Utilisation de la méthode de transfert de gouttelettes pour préparer de manière fiable des vésicules unilamellaires géantes

Nous visons des microrobots de type cellulaire qui naviguent dans les tissus corporels pour administrer des thérapies localement. Ils sont basés sur des vésicules unilamellaires géantes et une membrane phospholipidique et contiennent des particules actives. Ce protocole propose un guide pour les débutants qui souhaitent adopter et adapter la méthode de transfert de gouttelettes en biologie synthétique et dans d’autres domaines, par exemple, en microrobotique.

Comparé à d’autres techniques de préparation GUV, ce protocole offre une efficacité d’encapsulation élevée et une exécution simple, ce qui le rend accessible à tout groupe de recherche disposant d’un équipement de laboratoire de base. Nous évaluerons la navigation de microrobots basés sur GUV dans des environnements semblables à ceux des tissus et mettrons en œuvre des stratégies de détection pour permettre un mouvement autonome vers les cellules malades. Pour commencer, déplacez la chambre du gant à l’intérieur ou à côté d’un capot chimique.

Ouvrez la chambre du gant et placez un cristalliseur rempli de particules de silice au fond de la chambre. Couvrez le cristalliseur avec une surface de support blanche, puis superposez-le avec du papier absorbant. Insérez tous les matériaux nécessaires dans la chambre à gants et placez le flacon en verre contenant la solution de chloroforme sur un porte-anneau en liège ou un bécher de 150 millilitres positionné aussi près que possible du côté de l’opérateur.

Maintenant, fermez la chambre à gants, en vous assurant que les deux moitiés sont bien alignées et ne peuvent pas glisser. Utilisez les vis en plastique fournies pour sceller complètement la chambre. Fermez la vanne de sortie et plongez le tuyau numéro cinq dans un bécher de 500 millilitres à moitié rempli d’eau.

Ensuite, connectez l’extrémité régulée par la vanne du tuyau numéro deux à la conduite de vide. Ensuite, connectez l’autre extrémité à la conduite d’azote à l’aide du tuyau numéro trois. Ouvrez la valve et ouvrez la conduite d’aspiration jusqu’à ce que les gants se gonflent et deviennent trop rigides pour être pliés.

Ensuite, fermez à la fois la conduite de vide et la vanne. Ensuite, ouvrez la ligne d’azote jusqu’à ce que les gants se dégonflent et s’étendent hors de la chambre des gants. Après avoir enfilé les gants, à l’aide d’une seringue Hamilton, transférez le volume spécifié de DOPC dans une solution de chloroforme dans un flacon en verre foncé.

Fermez le flacon avec le bouchon contenant les aiguilles. Maintenant, connectez le tuyau numéro six au tuyau numéro huit et le tuyau numéro sept au tuyau numéro neuf à l’aide des jonctions à deux voies. Retirez les gants de la chambre à gants et ouvrez la soupape de sortie.

Ensuite, ouvrez lentement la conduite d’azote et surveillez le flux de gaz pour détecter la présence de bulles dans le bécher. Augmentez progressivement le débit d’azote jusqu’à ce qu’un taux de bouillonnement régulier mais observable soit atteint. Après trois minutes d’écoulement, fermez la conduite d’azote.

Une fois que la dernière bulle sort du bécher, fermez la vanne de sortie. Remettez les gants et débranchez les tuyaux huit et neuf des jonctions à double sens. Ensuite, ouvrez le flacon et remettez le capuchon dans le tube de 50 millilitres.

Ouvrez ensuite la bouteille d’huile et transférez la quantité d’huile requise dans le flacon sombre. Fermez à nouveau le flacon avec le bouchon, retirez les gants et ouvrez la chambre du gant. Agitez vigoureusement le flacon de suspension lipidique scellé pendant au moins 30 secondes.

Ensuite, incubez-le à 80 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 30 minutes. Après avoir à nouveau vortex le flacon, incubez-le pendant la nuit à température ambiante. À l’aide de ciseaux, coupez le capuchon d’un tube de cinq millilitres.

Percez un trou d’environ huit millimètres au centre du capuchon pour y installer une pointe de pipette P1000. Si le trou est trop large pour s’adapter à la pointe, jetez le capuchon et recommencez avec un nouveau. Avec une bande de papier de verre de deux x cinq centimètres, lissez les bords du trou percé.

Remettez le capuchon sur le tube de cinq millilitres et centrifugez à 3 000 g pendant cinq minutes pour éliminer toute particule de plastique résiduelle. Ensuite, retirez le capuchon et jetez le tube. Maintenant, coupez le capuchon d’un nouveau tube de cinq millilitres et remplacez-le par le capuchon percé préparé.

Insérez une pointe P1000 à travers le trou avec un joint torique verrouillé entre la pointe et le capuchon pour éviter tout mouvement ultérieur vers le bas. Remplissez le tube avec 5,5 millilitres de solution extérieure par l’embout. Vortex le flacon de suspension lipidique préparé plus tôt pendant au moins 30 secondes.

Ensuite, incubez-le dans le bain-marie à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes. Laissez les solutions d’eau préparées plus tôt s’équilibrer à température ambiante pendant au moins 10 minutes. Maintenant, pipetez 300 microlitres de solution externe dans un tube de 1,5 millilitre ou le tube de cinq millilitres précédemment modifié.

Superposez lentement 100 microlitres de suspension lipidique sur la solution huileuse, en assurant la formation de deux phases distinctes et continues. Laissez l’interface tranquille pendant 10 minutes pour s’équilibrer. Dans un tube de deux millilitres, pipetez 250 microlitres de suspension lipidique, suivis de 6,25 microlitres de solution interne pour préparer une émulsion d’eau dans l’huile à 2,5 %.

Mélangez les deux phases jusqu’à ce que l’émulsion apparaisse homogène et stable. Transférez 200 microlitres de l’émulsion préparée sur l’interface de suspension lipidique de la solution huileuse formée précédemment. Si vous utilisez un tube de 1,5 millilitre, fermez simplement le tube.

Si vous utilisez le tube modifié de cinq millilitres, placez un capuchon en caoutchouc sur la pointe de la pipette et transférez doucement l’ensemble du tube dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez les tubes à température ambiante et à la vitesse appropriée. Après centrifugation, vérifiez qu’une pastille opaque est présente en bas et que la phase huileuse est claire en haut.

Pour retirer l’huile du tube de cinq millilitres contenant des GUV, récupérez la pointe de la pipette du tube tout en vous assurant que le capuchon en caoutchouc reste en place. Jetez l’embout et conservez le capuchon en caoutchouc, le joint torique et le capuchon pour une utilisation future. Au lieu de cela, si vous utilisez un tube de 1,5 millilitre, utilisez une micropipette P1000 pour retirer la solution d’huile, en laissant derrière vous environ 50 microlitres et en vous assurant de ne pas déranger la pastille.

Changez l’embout de la pipette, puis remettez la pastille en suspension dans les 50 microlitres restants de la solution. Enfin, transférez le matériau remis en suspension dans un tube propre de deux millilitres. Les solutions lipidiques préparées dans des conditions d’humidité élevée ont produit des vésicules unilamellaires géantes avec des rendements nettement inférieurs et une plus grande prévalence d’agrégats désordonnés par rapport à celles préparées dans une chambre à humidité contrôlée, bien que certains agrégats soient encore présents dans cette dernière.

À 3 300 g pendant 20 minutes, le rendement et la qualité des vésicules chargées de saccharose étaient optimaux, tandis que des vitesses de centrifugation inférieures et supérieures permettaient des résultats défavorables, tels qu’un rendement réduit ou la formation d’agrégats. L’huile minérale a donné des vésicules avec une distribution de diamètre moyen plus grande, tandis que l’huile de silicone AR 20 a généré un nombre global de vésicules significativement plus élevé.