Analyse 3D simultanée des lésions cardiaques et de la réponse immunitaire dans l’infarctus aigu du myocarde reperfusé à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière

Nous examinons l’interaction entre les cellules immunitaires et les tissus endommagés après un infarctus du myocarde. Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire et d’améliorer la fonction cardiaque. Il a été proposé qu’après un infarctus du myocarde, les trois principales entités cellulaires, les cardiomyocytes et les cellules et les cellules immunitaires, doivent être modulées par des stratégies multi-cibles en même temps.

En plus de l’analyse simultanée des lésions cardiaques et de la réponse, nous avons pu montrer une localisation 3D de ces zones endommagées, ce qui était auparavant inconnu. L’analyse 3D, en particulier lors du multiplexage de diverses cibles, offre un moyen plus robuste d’évaluer la composition cellulaire après un infarctus du myocarde. Pour commencer, placez la souris euthanasiée sous un microscope stéréoscopique.

À l’aide de ciseaux fins, ouvrez la cavité thoracique et incisez la veine cave supérieure exposée près de la sortie du vaisseau de la cage thoracique vers le cou. À l’aide d’une aiguille de calibre 27 attachée à une pompe à rouleau, perfuser le cœur in situ via les oracles auriculaires droit et gauche avec du PBS contenant de l’héparine. Confirmer un prélèvement sanguin cardiaque suffisant en observant l’estompement du dessin vasculaire superficiel du cœur et le blanchiment des poumons et du foie.

Excisez le cœur ainsi qu’au moins cinq millimètres de l’aorte restante et du tissu pulmonaire environnant à l’aide de pinces et de ciseaux, et transférez-le dans une boîte de Pétri de six centimètres préremplie de PBS glacé et de gaze. Maintenant, coupez le tissu restant, les tissus pulmonaires, adipeux et vasculaires jusqu’à ce qu’il ne reste que le cœur avec environ cinq millimètres d’aorte. Transférez le cœur dans un plat préparé pour la canulation aortique et tirez l’aorte restante sur une canule en acier émoussé de calibre 20.

Fixez-le à l’encoche de la canule avec une jolie suture 5-0. Légez l’artère descendante antérieure gauche de façon permanente avec une suture 6-0 à l’endroit utilisé pour l’induction de l’infarctus aigu du myocarde reperfusé. Injectez 400 microlitres de PBS contenant 20 microgrammes d’anticorps NT CD31 de souris, marqué avec un LexaFluor 546 rétrograde via la canule insérée.

Retirez délicatement la canule de l’aorte et transférez le cœur dans un tube de réaction en polypropylène de 15 millilitres contenant 10 millilitres de paraformaldéhyde à 4 %. Incuber le tube pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité sans agitation. Lavez le cœur fixé en trois changements de cinq millilitres de PBS pendant 10 minutes chacun à température ambiante dans l’obscurité, en utilisant une rotation presque aérienne pour l’agitation à l’intérieur de tubes de réaction en polypropylène de cinq millilitres.

Déshydratez le cœur fixé dans cinq millilitres d’éthanol à 50 % dans de l’eau déminéralisée pendant au moins deux heures à température ambiante dans l’obscurité, en agitant avec une rotation presque aérienne dans des tubes de réaction de cinq millilitres. Pour blanchir le cœur déshydraté, transférez-le dans un tube de réaction de 15 millilitres contenant 10 millilitres d’éthanol à 100 % avec 5 % de diméthylsulfoxyde et 5 % de peroxyde d’hydrogène, et incubez-le à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant quatre heures sans agitation. Lavez le cœur blanchi dans cinq millilitres d’éthanol à 100 % trois fois pendant 12 heures chacune à température ambiante dans l’obscurité, en utilisant une rotation presque aérienne pour l’agitation dans des tubes de réaction de cinq millilitres.

Transférez le cœur dans un tube réactionnel de cinq millilitres contenant quatre millilitres de cinnamate d’éthyle et incubez-le sans agitation pendant trois jours à température ambiante dans l’obscurité. Coupez les blocs de gel et de gomme éliminés à une taille qui stabilise le cœur dégagé dans le porte-échantillon du microscope. Utilisez un objectif à ouverture numérique de 0,1 avec une distance de travail de 17,6 millimètres pour l’acquisition d’images.

Détectez ensuite les signaux de fluorescence à l’aide des paramètres de filtre d’excitation et d’émission appropriés. Pour l’imagerie par microscopie à feuillet de lumière, choisissez une ouverture numérique de feuille de 0,079, ce qui donne une épaisseur de feuille de cinq micromètres. Réglez la distance entre deux plans Z individuels à 10 micromètres.

Utilisez une largeur de feuille de 100 % pour obtenir un éclairage homogène de l’échantillon. Cette figure illustre les coupes cardiaques représentatives localisant la zone à risque, les lésions endothéliales et les neutrophiles infiltrés par coloration d’anticorps multicanaux et autofluorescence. La zone à risque a été identifiée par l’absence de coloration CD31 après injection rétrograde, une lésion endothéliale par négativité intraveineuse de CD31 et une infiltration de neutrophiles par des points positifs à Ly6G, principalement près des zones de lésion.

Les rendus 3D ont montré un chevauchement entre l’AAR, les lésions endothéliales et les amas de neutrophiles, suggérant une localisation immunitaire spécifique à la région. La quantification a montré que 90,2 % des neutrophiles étaient présents dans les zones AAR contre 9,8 % dans les régions éloignées, ce qui indique une inflammation localisée. Dans l’AAR, 79,3 % des neutrophiles étaient à l’extérieur des volumes de lésions endothéliales et 20,7 % à l’intérieur, suggérant un regroupement périphérique autour des lésions.