Isolement, culture et caractérisation des fibroblastes associés au cancer de la prostate

Notre objectif est de comprendre le mécanisme par lequel les fibroblastes associés au cancer contribuent à la progression tumorale dans le cancer de la prostate, dans le but de neutraliser cette diaphonie en tant que stratégie thérapeutique. Des populations distinctes de CAF avec des propriétés différentes peuvent être évaluées dans des organoïdes 3D obtenus à l’aide de cellules tumorales et stromales lors de diverses manipulations. Notre protocole permet de générer de manière fiable des CAF à ces fins.

Les principaux défis sont l’isolement fiable des cellules tumorales et normales à partir des microenvironnements des mêmes patients, l’hétérogénéité, l’absence de marqueurs spécifiques des CAF, la plasticité des CAF, et les modèles in vitro limités récapitulant la complexité des ETC. Avec des méthodes similaires, nous avons caractérisé le rôle pro-tumoral fondamental du facteur de transcription STAT3 et de ses gènes cibles dans les CAF du cancer du sein murin, démontrant leur efficacité en tant que cibles thérapeutiques. Un isolement optimal des fibroblastes de la tumeur et des régions normales adjacentes d’échantillons de prostatectomie radicale obtenus chez des patients atteints de cancer de la prostate en utilisant une petite quantité de tissu.

Pour commencer, pesez les échantillons de tissus sur la balance le premier jour pour l’isolement des fibroblastes. À l’aide d’une pince stérile, transférez le tissu dans des boîtes de six centimètres. Lavez le mouchoir deux fois dans quatre millilitres de PBS glacé et deux fois dans quatre millilitres de DMEM complet glacé.

Maintenant, transférez le tissu dans une plaque de six centimètres sur de la glace. Ajoutez un millilitre de DMEM supplémenté en antibiotiques dans l’assiette. Ensuite, utilisez des ciseaux ou des lames pour hacher le tissu en fragments inférieurs à un millimètre carré.

Transférez le tissu haché dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de DMEM complet glacé. Ensuite, centrifugez la suspension à 754 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, retirez le surnageant.

Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de DMEM complet glacé et centrifugez-la à nouveau. Après avoir retiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans la solution de collagénase II. Transférez la suspension dans des microtubes de 1,5 millilitre.

Scellez les microtubes avec un film de paraffine. Ensuite, placez-les à 37 degrés Celsius pour une digestion pendant la nuit avec un balancement continu pendant huit à 12 heures. Le lendemain, transférez les échantillons digérés dans des tubes coniques de 15 millilitres.

Pipetez cinq millilitres de DMEM complet glacé pour inactiver la collagénase. Ensuite, centrifugez la suspension à 754 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Remettre la pastille en suspension dans un millilitre de trypsine-EDTA à 0,05 % après avoir pipeté le surnageant.

Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius en secouant de temps en temps. Ensuite, pipetez un millilitre de solution de DNase I fraîchement préparée sur les échantillons et mélangez bien. Après avoir centrifugé et éliminé le surnageant, remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de DMEM complet à froid et centrifuger à nouveau.

Remettre en suspension les cellules résultantes dans du DMEM complet complété par 20 % de sérum de veau fœtal. Plaquez les cellules et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité pendant au moins trois jours. Après trois jours, examinez la morphologie et la viabilité des cellules.

Une fois que les cellules atteignent la confluence, passez-les dans une boîte de 10 centimètres contenant du DMEM complet avec 20 % de sérum de veau fœtal. Plaques de fibroblastes associés au cancer ou de fibroblastes normaux à 70 % de confluence dans des plaques à 12 puits. Le lendemain, ajoutez 0,45 gramme de gélose à bas point de fusion à 12,5 millilitres de PBS dans un tube conique de 50 millilitres dans des conditions stériles.

Dissoudre le mélange à l’aide d’un four à micro-ondes. Refroidissez la solution de gélose à 37 degrés Celsius. Ensuite, diluez dans un rapport de un à quatre avec du DMEM complet préchauffé pour préparer une solution de travail.

Aspirez le milieu de la plaque à 12 puits. Pipeter 500 microlitres de la solution de gélose de travail dans chaque puits. Incuber pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius pour permettre la solidification de la gélose.

Pendant ce temps, maintenez le reste de la solution de gélose à 37 degrés Celsius. Trypsinisez les cellules tumorales et préparez une suspension cellulaire de 20 000 cellules par millilitre. Mélangez des volumes égaux de suspension de cellules tumorales et de solution de gélose pour obtenir un volume final de sept millilitres, ce qui représente trois réplicats techniques pour chaque condition.

Pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour assurer un mélange uniforme. Ensuite, distribuez 500 microlitres de ce mélange contenant environ 5 000 cellules sur la couche de base solidifiée dans chaque puits. Après avoir laissé la gélose se solidifier pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, ajoutez un millilitre de DMEM complet dans chaque puits.

Changez de milieu tous les deux jours en aspirant doucement à partir du bord du puits et en ajoutant du milieu frais au centre. Incuber jusqu’à ce que les colonies deviennent facilement visibles. Une fois que les colonies sont visibles, jetez le milieu de culture.

Ensuite, colorez les colonies avec 200 microlitres de solution de chlorure de tétrazolium Nitro blue. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié. Le lendemain, jetez la solution de coloration.

Acquérir des images de colonies colorées à l’aide d’un stéréomicroscope. Des fibroblastes purs ont été isolés avec succès. Dans de nombreux cas, en particulier lors des passages précoces, les fibroblastes associés au cancer présentaient une morphologie plus fusiforme que les fibroblastes normaux.

L’analyse quantitative a confirmé que la prolifération des cellules DU145 traitées avec des milieux conditionnés aux fibroblastes associés au cancer était significativement plus élevée sur 120 heures que celles traitées avec des milieux normaux conditionnés aux fibroblastes ou non traitées. Les cellules DU145 co-cultivées directement avec des fibroblastes associés au cancer et des fibroblastes normaux ont également montré une prolifération accrue sur 96 heures par rapport aux témoins. Les courbes de croissance correspondantes ont démontré que la co-culture avec des fibroblastes normaux et associés au cancer entraînait une augmentation similaire de la prolifération de l’UD145 au fil du temps.

L’effet des milieux conditionnés sur la prolifération de DU145 variait entre les paires de fibroblastes associés au cancer et les paires de fibroblastes normaux, les paires de passages précoces montrant des effets significativement plus forts que les paires ultérieures. Dans les essais de formation de colonies de gélose molle, les fibroblastes associés au cancer et normaux ont augmenté le nombre et la taille des colonies de DU145 par rapport aux témoins, ce qui indique une croissance accrue indépendante de l’ancrage. Des couches de fibroblastes détachées formées en raison de problèmes techniques ont empêché la formation de colonies chez certaines répétitions.

Les milieux conditionnés seuls n’ont pas favorisé la formation de colonies indépendantes de l’ancrage dans les cellules DU145.