Name: Visualisation d’organoïdes rétiniens entiers avec résolution cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie confocale par immunomarquage et clarification optique pour visualiser des organoïdes rétiniens entiers avec résolution cellulaire. Cette approche révèle l'organisation tridimensionnelle des neurones.

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1. Préparation d’anticorps secondaires fluorescents sur mesure
REMARQUE : Cette approche sert d’alternative à l’utilisation d’anticorps fluorescents commerciaux (voir la discussion pour les avantages de la préparation d’anticorps secondaires fluorescents). De plus, ce protocole peut être utilisé pour conjuguer des fluorophores à des anticorps primaires dans le cas où une immunofluorescence directe doit être réalisée et que l’anticorps primaire fluorescent n’est pas disponible dans le commerce. Le contrôle du rapport fluorophore/anticorps en ajustant la quantité de fluorophore dans la réaction de marquage produit des anticorps conjugués plus brillants. Cependant, les anticorps secondaires fabriqués sur mesure sont moins stables et la concentration du conjugué résultant est 10 fois inférieure à celle des anticorps fluorescents commerciaux. Ce protocole est adapté des travaux décrits par Bálint et al9.
<ol>
	<li>Dissoudre 1 mg de fluorophore dans du DMSO anhydre et aliquote dans des tubes pour un total final de 0,02 mg de fluorophore par tube. Retirez tout DMSO à l’aide d’un concentrateur sous vide rapide, pendant 1 h et 30 min. Stocker les aliquotes à -20 ºC à l’abri de la lumière. Pour Alexa Fluor 405, leH2O ultrapur est le solvant approprié pour la fabrication d’aliquotes.</li>
	<li>Pour effectuer la réaction de marquage, dissoudre une aliquote du fluorophore dans 1-10 μL de DMSO (ouH2O ultra-pur pour Alexa Fluor 405). REMARQUE : La quantité exacte de DMSO est déterminée par des tests de conjugaison de contrôle précédents. Ces tests sont effectués lorsqu’un nouveau lot d’un fluorophore doit être utilisé (ou lorsqu’il n’y a plus d’un lot de fluorophore précédent), ou lorsqu’un nouveau fluorophore est utilisé pour la première fois dans la conjugaison. L’essai de conjugaison témoin consiste à effectuer des réactions de marquage avec des quantités variables de fluorophore afin de déterminer le rapport fluorophore/anticorps optimal dans le conjugué. Dans notre cas, le rapport optimal se situe généralement entre 3 μL et 5 μL.</li>
	<li>Incuber 50 μL d’IgG secondaires (ou primaires), 6 μL de 1 M de NaHCO3 et 1 à 5 μL de fluorophore pendant 40 min à température ambiante (RT) sur une plate-forme basculante, à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Pendant que la réaction progresse, préparez les colonnes d’exclusion de taille de purification en retirant leurs couvercles et en laissant passer le tampon. Équilibrez la colonne (une pour chaque réaction d’étiquetage) en faisant passer 3 x 2-3 mL de PBS dans la colonne. Dans le cas où la dernière étape d’équilibrage se termine avant la fin de l’incubation, remettez les couvercles en place pour éviter qu’ils ne se dessèchent et attendez la fin de la réaction d’étiquetage. REMARQUE : Les colonnes d’exclusion de taille de purification fonctionnent par gravité. Assurez-vous que la colonne ne se tarit pas à tout moment, sinon la réaction de purification ne fonctionnera pas correctement.</li>
	<li>Lorsque la réaction est terminée (étape 1.3), ajoutez 140 μL de PBS à la réaction de marquage pour obtenir un volume d’environ 200 μL et tourbillonnez-le. Ajoutez cette solution au centre de la colonne, laissez l’échantillon entrer dans la colonne et, une fois la dernière goutte éluée, poussez en ajoutant 550 μL de PBS. Lorsque le liquide cesse de tomber, éluer en ajoutant 300 μL de PBS et recueillir dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.</li>
	<li>Calculez la concentration en anticorps et les rapports de marquage en mesurant l’absorbance de l’échantillon à 280 nm et l’absorbance des fluorophores utilisés. Appliquez la loi de Beer-Lambert pour déterminer la concentration (en molarité) comme suit : 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> Où A représente l’absorbance, ε le coefficient d’extinction molaire, et CF280 est une mesure de l’absorbance du fluorophore spécifique à 280 nm qui sert de facteur de correction. Ensuite, la concentration de l’anticorps est : 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> Et le rapport d’étiquetage est de : 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg"></li>
	<li>Conservez les anticorps marqués à 4 ºC, à l’abri de la lumière, jusqu’à 6 mois.</li>
</ol>
2. Marquage par immunofluorescence
<ol>
	<li>Fixez les organoïdes avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) à RT pendant 45 min. REMARQUE : FACULTATIF : Incuber les organoïdes avec une solution de récupération d’antigènes (étapes 2.2 et 2.3) pour améliorer l’immunoréactivité des antigènes.</li>
	<li>Préparez 40 mL de solution de récupération d’antigène en mélangeant 0,117 mg de citrate tribasique de sodium dihydraté dans du H2O ultrapur et ajustez à pH 9.</li>
	<li>Incuber les organoïdes avec la solution de récupération d’antigène en agitant doucement (30 tr/min) à 60 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Perméabiliser les organoïdes avec du PBST (PBS avec 1 % de Triton X-100) en agitant légèrement à RT pendant 4 h.</li>
	<li>Bloquez les organoïdes avec une solution bloquante (albumine sérique bovine (BSA) à 2 % avec Triton X-100 à 0,1 %) à la RT pendant la nuit (ou pendant 1 jour). REMARQUE : Les concentrations d’anticorps primaires et secondaires dépendent de l’anticorps particulier. Pour l’immunofluorescence d’échantillons entiers, nous utilisons une concentration plus élevée par rapport aux échantillons sectionnés. Nous incubons l’anticorps primaire à 10 μg/mL, ce qui, dans la plupart des cas, correspond à 1:100 de la mère (tableau 1). Nous incubons nos anticorps secondaires sur mesure à une dose de 20 à 50 μg/mL.</li>
	<li>Incuber les organoïdes avec les anticorps primaires dilués dans une solution de lavage (0,1 % BSA avec 0,1 % de Triton X-100) à 4 °C pendant 2 jours en agitant doucement.</li>
	<li>Lavez les organoïdes pendant 3 x 15 min dans une solution de lavage en les secouant légèrement à RT.</li>
	<li>Incuber les organoïdes avec les anticorps secondaires dilués dans une solution de lavage à 4 °C pendant 2 jours en agitant doucement.</li>
	<li>Lavez les organoïdes pendant 3 x 15 min dans une solution de lavage en les secouant légèrement à RT. REMARQUE : Après l’immunomarquage, les colorants fluorescents de votre choix peuvent être incubés. Nous utilisons normalement des marqueurs de noyaux fluorescents, tels que DAPI (1:1 000) et DRAQ5 (1:500), ou phalloïdine (1:100) pour visualiser le réseau de filaments d’actine.</li>
	<li>Incuber les organoïdes avec les colorants fluorescents dilués dans une solution de lavage à RT pendant 1 h en secouant doucement.</li>
	<li>Lavez les organoïdes pendant 3 x 15 min dans une solution de lavage en les secouant légèrement à RT.</li>
</ol>
3. Dégagement optique avec FluoClear BABB
REMARQUE : Le 1-Propanol peut compromettre les contenants en plastique, en particulier pour une exposition à long terme. Pour plus de sécurité, utilisez des récipients en verre.
<ol>
	<li>Étape de déshydratation<ol>
		<li>Préparez des solutions de 1-propanol dans du H2O ultrapur aux pourcentages donnés (15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 %, 90 %), puis ajustez à pH 9,5 avec de la triméthylamine. ATTENTION : La triéthylamine est toxique si elle est inhalée. Travaillez sous une hotte. Les solutions peuvent être réutilisées si elles sont stockées correctement (contenant bien scellé). Ajustez le pH avant utilisation.</li>
		<li>Incuber les échantillons avec le gradient croissant de solutions de 1-propanol (15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 %, 90 %) pendant 2 h chacun à 30 °C en agitant doucement.</li>
		<li>Incuber les échantillons avec du 1-propanol à 100 % pendant la nuit à 30 °C en secouant doucement.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Étape de déblaiement ATTENTION : BABB est un puissant mélange de solvants connu pour sa capacité à dissoudre ou à endommager considérablement de nombreux plastiques. Pour plus de sécurité, utilisez des récipients en verre avec des couvercles compatibles et travaillez à l’intérieur d’une hotte.<ol>
		<li>Préparez le BABB en mélangeant de l’alcool benzylique (BA) et du benzoate de benzyle (BB) dans un rapport de 1:2.</li>
		<li>Immergez les échantillons dans BABB à RT pendant la nuit.</li>
		<li>Avant l’imagerie, actualisez le BABB. REMARQUE : Pour les organoïdes de ~1 mm de diamètre, BABB induit un effet de clarification qui est évident en quelques dizaines de minutes. Selon la taille et la nature de l’échantillon, le degré de clairance peut être différent et/ou nécessiter un temps d’exposition plus long à la solution de clarification. Nous vous recommandons d’acquérir des images avant et après l’immersion BABB afin d’améliorer le protocole de nettoyage.</li>
		<li>Stocker à long terme à 4 °C les échantillons débarrassés de BABB avec une solution de BABB. Protéger de la lumière pour préserver la fluorescence.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Acquisition d’images sur l’ensemble de la monture
<ol>
	<li>À l’aide d’une pipette en verre, placez l’organoïde dans une boîte de Pétri à fond de verre avec une goutte de BABB. Assurez-vous que l’échantillon entre en contact avec la surface du verre de protection. ATTENTION : Veillez à ce que la goutte de BABB contenant l’échantillon n’entre pas en contact avec les bords en plastique de la boîte, sinon elle fera fondre le plastique, compromettant ainsi l’échantillon et la qualité de l’imagerie.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope confocal à balayage laser inversé équipé d’objectifs à faible et fort grossissement, acquérez des images de la pile Z pour obtenir une vue d’ensemble 3D complète de l’échantillon avec des détails cellulaires. REMARQUE : Pour cette étude, un objectif aérien à ouverture numérique (NA) 10x 0,4 et un objectif à 63x NA 1,4 ont été utilisés, avec une taille de pas de 3,5 μm et 1 μm, respectivement.</li>
</ol>
5. Traitement d’image
<ol>
	<li>Recalibrez la taille du pas de l’acquisition de la pile Z en tenant compte de l’inadéquation de l’indice de réfraction (IR) entre la solution de clarification et le milieu d’immersion.<ol>
		<li>Calculez la taille de pas recalibrée comme suit : 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg"> Pour un échantillon intégré dans BABB, imagé avec un objectif aérien avec une taille de pas de 3,5 μm, ce sera comme suit : 
		<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"></li>
		<li>À l’aide d’ImageJ, modifiez la profondeur du voxel (cliquez sur Image | Propriétés...) pour la taille de pas recalculée.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Créez des projections d’images de la pile Z.<ol>
		<li>À l’aide d’ImageJ, inspectez la pile Z en profondeur (cliquez sur Image | Piles | Vues orthogonales). Les vues XY, XZ et YZ de l’organoïde rétinien apparaîtront.</li>
		<li>Enregistrez les régions d’intérêt souhaitées (cliquez sur Fichier | Enregistrer sous...).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Créez une animation du rendu 3D de la pile Z à l’aide d’un logiciel de traitement (voir la Table des matériaux).<ol>
		<li>Sélectionnez les canaux à visualiser en cochant leurs cases.</li>
		<li>Ajustez les plans Z pour visualiser l’intérieur de l’échantillon (activez l’option Écrêtage dans la case à cocher).</li>
		<li>Enregistrez l’animation à l’aide de l’éditeur de films (activez l’éditeur de films dans la case à cocher). Glissez-déposez, zoomez et dézoomez directement à l’aide de la souris. Cliquez sur Ajouter pour inclure un autre clip pour l’animation. Si vous ajustez les plans Z, activez l’option Plans de coupe (cliquez sur Paramètres... | cochez la case Clips planes ).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Darche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+of+cleared+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes.</a> Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x objectif NA0.40 DRY</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>63x objectif NA1.40 OIL</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>anticorps anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>AB13970</td><td>-</td></tr><tr><td>Alcool benzylique (BA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>Benzoate de benzyle (BB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre à fond</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorps Chx10</td><td>Sta Cruz Biotech</td><td>SC-365519</td><td>-</td></tr><tr><td>Colonnes de filtration gel Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>-</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermopêcheur</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>Colorant (acide carboxylique, ester de succinimidyle)</td><td>Invitrogen ou Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageJ/Fidji&nbsp ;</td><td>NIH</td><td>&nbsp ; v1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser inversé</td><td>Microsystèmes Leica</td><td>TCS SP8 STED 3X-FALCON</td><td>-</td></tr><tr><td>Logiciel de traitement 3D LAS X</td><td>Microsystèmes Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Eau ultrapure issue du système de purification d’eau Synergy</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organics</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>IgG secondaires non marquées</td><td>Jackson Immunorecherche</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorps bleu d’opsine</td><td>Millipore&nbsp ; &nbsp ;</td><td>AB5407&nbsp ;</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorps Opsin RG</td><td>Millipore</td><td>AB5745&nbsp ;</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA) 4 %</td><td>Thermo scientifique&nbsp ;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>PBS Solution</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>Sondes de marquage à la phalloïdine</td><td>Thermopêcheur</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorps RECOV</td><td>Millipore</td><td>AB5585-I&nbsp ;</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorps RHO (RET-P1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O4886&nbsp ;</td><td>-</td></tr><tr><td>Citrate de sodium tribasique dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Réf. C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Réf. T8787</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorps TUJ1</td><td>Covance&nbsp ;</td><td>MMS-435P&nbsp ;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

visualisation d’organoïdes rétiniens entiers avec résolution cellulaire

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

Visualisation d’organoïdes rétiniens entiers avec résolution cellulaire

Retinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells are intricate 3D structures that mimic the human retina, offering a powerful platform ...

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In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes

Toute la structure 3D et la teneur cellulaire des organoïdes, ainsi que leur ressemblance phénotypique avec le tissu d’origine peuvent être capturés à l’aide du protocole d’imagerie 3D à résolution unicellulaire décrit ici. Ce protocole peut être appliqué à un large éventail d’organoïdes variant dans l’origine, la taille et la forme.

Imagerie tridimensionnelle à résolution unicellulaire des Organoïdes intacts

Une technique chirurgicale de transplantation de tissu rétinien dérivé de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) dans l’espace sous-rétinien d’un grand modèle animal est présentée ici.

Transplantation sous-rétinienne de tissu rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans un modèle félin de grand animal

Cette étude vise à développer un nouveau modèle de culture rétinienne organotypique humaine (HORC) qui empêche de compromettre l’intégrité rétinienne lors de la manipulation des explants. Ceci est réalisé en cultivant la rétine avec le vitré sous-jacent et le pigment rétinien sous-jacent épithélium-choroïde (RPE-choroïde) et la sclérotique.

Caractérisation d’une nouvelle technique de culture rétinienne organotypique humaine

En utilisant une méthode d’auto-organisation, nous développons un protocole avec l’ajout de COCO qui pourrait augmenter considérablement la génération de photorécepteurs.

Induction dirigée d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Nous décrivons ici un système d’induction organoïde rétinienne optimisé, qui convient à diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées.

Système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole décrit une méthode efficace pour différencier les CSPhi en groupes de champs oculaires et générer des organoïdes neuro-rétiniens en utilisant des conditions de culture simplifiées impliquant à la fois des systèmes de culture adhérents et en suspension. D’autres types de cellules oculaires, telles que l’EPR et l’épithélium cornéen, peuvent également être isolés à partir de champs oculaires matures dans des cultures rétiniennes.

Génération d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes saines et spécifiques à une maladie rétinienne

Ce protocole fournit une procédure de préparation optimisée et élaborée pour les échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission. Il convient aux applications qui impliquent l’analyse des synapses dans les organoïdes rétiniens matures.

Préparation d’échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission

Les microglies sont des cellules immunitaires résidentes uniques dans la rétine, jouant un rôle crucial dans diverses maladies dégénératives de la rétine. La génération d’un modèle de co-culture d’organoïdes rétiniens avec des microglies peut faciliter une meilleure compréhension de la pathogenèse et de la progression du développement des maladies rétiniennes.

Assemblage d’organoïdes rétiniens avec la microglie

La rétine présente une organisation spatiale complexe à travers sa structure laminaire. Les techniques modernes de transcriptomique spatiale et de séquençage nécessitent des coupes de tissus &lt; 20 μm d’épaisseur, ce qui limite leur applicabilité à la recherche rétinienne. Cette méthode de cryosectionnement fraîchement congelée produit de fines sections de la rétine de la souris tout en préservant les relations spatiales planes, permettant une cartographie moléculaire complète à travers les...

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Découvrez une méthode d'imagerie confocale par immunomarquage et clarification optique pour visualiser des organoïdes rétiniens entiers avec résolution cellulaire. Cette approche révèle l'organisation tridimensionnelle des neurones.

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