Visualisation d’organoïdes rétiniens entiers avec résolution cellulaire

Notre travail se concentre sur le développement et l’étude d’organoïdes rétiniens qui servent de modèle humain in vitro pour étudier comment la rétine humaine se forme, comment les maladies affectent et comment nous pourrions les traiter.

Pour faire avancer la recherche dans le domaine de la médecine régénérative, nous utilisons des organoïdes rétiniens 3D combinés à une clarification optique et à un immunomarquage pour visualiser des structures entières et étudier l’organisation particulière des cellules rétiniennes avec la microscopie confocale.

L’imagerie à monture entière est confrontée à des défis, tels que la pénétration inégale des anticorps dans les tissus denses et l’aberration sphérique dans les organoïdes, qui provoquent un marquage biaisé de surface et une perte de focale lors de la visualisation des tissus.

Notre méthode révèle les connexions cellulaires rétiniennes, les types de cellules, sous une organisation 3D, fournissant des informations cruciales sur les causes sous-jacentes des maladies rétiniennes.

[Instructeur] Pour commencer, procurez-vous les aliquotes fluorophores dissoutes dans du DMSO anhydre, déshydratées et congelées. Ajouter 1 à 10 microlitres de DMSO à une aliquote. Maintenant, combinez 50 microlitres d’immunoglobuline G secondaire ou d’anticorps primaire, six microlitres d’une molaire de bicarbonate de sodium et un à cinq microlitres de fluorophore, et incubez sur une plate-forme à bascule pendant 40 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Pendant que la réaction progresse, retirez les couvercles des colonnes d’exclusion de taille de purification et laissez passer le tampon. Équilibrez la colonne en faisant passer trois tours de deux à trois millilitres de PBS à travers la colonne. Si la dernière équilibrage se termine avant la fin de l’incubation, remettez les couvercles en place pour éviter qu’ils ne s’étirent, et attendez la fin de la réaction. Après l’incubation, ajoutez 140 microlitres de PBS à la réaction d’étiquetage pour porter le volume à environ 200 microlitres, et vortexez-le. Ajoutez la solution au centre de la colonne et laissez-la entrer dans la colonne. Une fois que la dernière goutte s’est échappée, poussez la solution avec 550 microlitres de PBS. Lorsque le liquide cesse de tomber, éluez avec 300 microlitres de PBS et collectez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Mesurez l’absorbance de l’échantillon à 280 nanomètres et aux longueurs d’onde spécifiques aux fluorophores pour calculer la concentration en anticorps et les rapports de marquage. Conservez les anticorps marqués à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière, jusqu’à six mois. Fixez les organoïdes rétiniens avec 4 % d’aldéhyde paraforme à température ambiante pendant 45 minutes. Après la fixation, ajoutez la solution de récupération d’antigène sur les organoïdes et incubez la boîte à 60 degrés Celsius, en secouant légèrement à 30 tours par minute pendant une heure. Ensuite, perméabilisez les organoïdes avec du PBS contenant 1 % de Triton X-100. Incuber le mélange à température ambiante, en secouant doucement pendant quatre heures. Maintenant, bloquez les organoïdes dans 2 % de BSA avec 0,1 % de Triton X-100 à température ambiante pendant la nuit ou pendant plus d’une journée. Le lendemain, ajoutez des anticorps primaires dilués aux organoïdes. Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux jours en secouant doucement. Lavez les organoïdes trois fois pendant 15 minutes chacun dans une solution de lavage à température ambiante en les secouant doucement. Maintenant, ajoutez les anticorps secondaires de la solution de dilution et incubez à quatre degrés Celsius pendant deux jours en secouant doucement. Après avoir lavé les organoïdes comme démontré précédemment, incubez les organoïdes avec des colorants fluorescents dilués dans une solution de lavage à température ambiante pendant une heure en secouant doucement. Ensuite, lavez à nouveau. Ensuite, préparez des solutions de 1-propanol dans de l’eau ultrapure à des concentrations de 15 %, 30 %, 45 %, 60 %, 75 % et 90 %, et ajustez chacune à un pH de 9,5 avec de la triméthylamine. Déshydrater les échantillons séquentiellement en gradients croissants de solutions de 1-propanol pendant deux heures chacune à 30 degrés Celsius en agitant doucement. Ensuite, transférez l’échantillon dans une solution de 1-propanol à 100 % et incubez toute la nuit à 30 degrés Celsius en secouant doucement. Pour la clarification de l’échantillon, préparez un mélange d’alcool benzylique et de benzoate de benzyle dans un rapport de un à deux pour obtenir une solution de BABB. Immergez les échantillons dans BABB à température ambiante pendant la nuit. Actualisez la solution BABB avant l’imagerie. À l’aide d’une pipette en verre, placez l’organoïde dans une boîte de Pétri à fond en verre avec une goutte de BABB, en vous assurant qu’il entre en contact avec la surface du verre de protection. Maintenant, utilisez un microscope à balayage laser confocal inversé avec des objectifs à faible et fort grossissement pour acquérir des images Z-stack pour une résolution cellulaire 3D. Recalibrez la taille du pas de l’acquisition de la pile Z en tenant compte de l’inadéquation de l’indice de réfraction entre la solution de nettoyage et le milieu d’immersion. Maintenant, lancez ImageJ, mettez à jour la profondeur du voxel en sélectionnant Image et en cliquant sur Propriétés pour créer des projections d’images de la pile Z. Inspectez la profondeur de la pile Z en sélectionnant Image, puis Piles et Vues orthogonales pour afficher les vues XY, XZ et YZ de l’organoïde rétinien. Enregistrez les régions souhaitées en cliquant sur Fichier et en sélectionnant Enregistrer sous. Enfin, créez une animation du rendu 3D de la Z-stack à l’aide d’un logiciel de traitement. Les organoïdes rétiniens éliminés par le fructose glycérol ont montré la moindre amélioration de la transparence, ce qui a entravé la visualisation du noyau de l’organoïde. L’élimination de l’ECI a amélioré la visualisation des couches rétiniennes, mais n’a toujours pas permis de révéler le noyau de l’organoïde en raison de la diffusion persistante de la lumière. Les organoïdes clairsemés par Fluoclear BABB ont présenté la transparence la plus élevée, révélant clairement à la fois le cortex et le noyau avec une fluorescence constante. Les organoïdes clairsemés ECI et fluoclear BABB présentaient un rétrécissement visible dans les images en fond clair en raison des étapes de déshydratation. Le rétrécissement induit par BABB a augmenté la compacité de l’échantillon, ce qui a permis d’utiliser des objectifs à fort grossissement pour imager des structures plus profondes. L’immunomarquage de TUJ1 à 40 jours in vitro a montré une seule couche neuronale mince sans stratification visible. À 90 jours, les cellules peuplaient densément la région apicale, et à 170 jours, l’organoïde présentait des signes clairs d’organisation en couches avec une zone apicale définie. À 200 jours, les projections cellulaires allongées s’étendaient de la surface vers l’intérieur vers le noyau, et l’organoïde se développait en trois couches rétiniennes distinctes à 250 jours. Les fibres neuronales se sont étendues du centre organoïde vers la périphérie au cours de la maturation, devenant plus épaisses et plus complexes au bout de 250 jours in vitro. Les photorécepteurs coniques exprimant des opsines bleues et vertes/rouges sont apparus à des stades tardifs et ont montré des morphologies allongées avec des pointes brillantes. Les photorécepteurs en bâtonnets exprimant la rhodopsine ont été identifiés par leur noyau central et la distribution périphérique de l’opsine. Les cellules positives au Chx10 ont d’abord été largement distribuées, mais ont ensuite été localisées spécifiquement dans la couche nucléaire interne pendant la maturation des organoïdes. L’expression endogène de GCaMP6s a été préservée après l’élimination de BABB, avec un signal GFP détectable dans la rétine neurale après une fixation à long terme.