La microscopie électronique à transmission comme technique de visualisation pour l’analyse de la plasticité synaptique circadienne dans le cortex cylindrique de la souris

Nous nous intéressons à la plasticité neuronale, en particulier aux changements circadiens de la plasticité des synapses, des neurones et des cellules gliales. Nous essayons de répondre à la question de savoir comment les synapses se transforment pendant le jour et la nuit et dans des conditions pathologiques. Les développements les plus récents dans notre domaine d’étude sont l’utilisation de divers outils génétiques pour manipuler l’expression des gènes, ainsi que l’utilisation de méthodes pour visualiser les changements dans le cerveau, ainsi que le nombre croissant de modèles animaux pour étudier les maladies neurodégénératives. Nous avons découvert, à l’aide d’un microscope à transmission électronique, que le nombre de synapses dans le cortex cylindrique des souris change au cours de la journée et de la nuit. Et ce rythme est également circadien, du moins en cas de synapses inhibitrices. Parce que les synapses inhibitrices, leur nombre augmente pendant la nuit, tandis que les synapses excitatrices augmentent pendant la journée. Des changements similaires ont été constatés dans le cerveau de la mouche des fruits. Chez cette espèce, le nombre de synapses change également au cours du jour et de la nuit. De plus, nous avons constaté des changements structurels dans la forme des neurones et des cellules gliales.

[Narrateur] Pour commencer, prenez le cervelet de la souris et divisez le cerveau en deux hémisphères. Choisissez un hémisphère et orientez-le de manière à ce que les sections puissent être coupées tangentiellement au cortex du canon. Ensuite, coupez les sections à une épaisseur de 60 micromètres et transférez-les dans une solution contenant un tampon de phosphate de 0,1 molaire et un fixateur dans un rapport de un à cinq. Examinez les sections au microscope optique et ne collectez que les sections qui montrent clairement le cortex du champ du canon. À l’aide d’un pinceau, transférez délicatement les sections dans une petite boîte de Pétri en verre. Rincer les sections cérébrales avec du cacodylate de 0,1 molaire. Ensuite, fixez les sections dans du tétroxyde d’osmium à 1 % dans un tampon cacodylate à 0,1 molaire avec du ferricyanure de potassium à 1,5 %. Une fois les sections rincées à l’eau distillée, utilisez une seringue avec un filtre de 25 millimètres pour distribuer lentement de l’éthanol à 70 % contenant 1 % d’acétate d’uranyle dans chaque boîte de Pétri avec des mouchoirs. Après une nuit d’incubation dans de l’éthanol à 70 % à quatre degrés Celsius, laver les mouchoirs dans de l’éthanol à 80 %, 90 % et 100 %. Ensuite, lavez les mouchoirs deux fois dans de l’oxyde de propylène pendant 10 minutes chacun. Ensuite, remplacez l’oxyde de propylène par deux millilitres d’un mélange individuel de résine Poly/Bed et d’oxyde de propylène. Couvrir avec un couvercle et incuber pendant 40 minutes. Intégrez les sections cérébrales dans deux millilitres d’un mélange trois pour un de résine Poly/Bed et d’oxyde de propylène. Couvrir et laisser agir 1,5 heure. Ensuite, coupez le film ACLAR en morceaux de la taille d’une lame de verre standard. À l’aide d’une pipette en plastique, appliquez un petit volume de résine sur chaque morceau de film ACLAR. À l’aide d’un pinceau, transférez les sections cérébrales de la boîte de Pétri à la résine du film ACLAR. Intégrez chaque section entre deux films ACLAR et incubez pour polymériser. À l’aide d’un microscope optique avec un objectif à deux vitesses, photographiez les sections cérébrales intégrées. Pour ouvrir les images, cliquez sur Fichier et Ouvrir, sélectionnez les images tout en maintenant la touche Maj enfoncée, puis cliquez sur Ouvrir. Commencez à empiler des images du cortex. Faites un clic droit sur le calque 1 dans chaque image, sélectionnez Dupliquer le calque et entrez le numéro de l’image comme nom dans la boîte de dialogue. Choisissez une image comme fichier de destination et cliquez sur OK. Ensuite, utilisez l’outil Déplacer pour aligner les images manuellement et ajustez l’orientation avec Modifier, Transformer, Pivoter ou Retourner si nécessaire. Pour des ajustements plus précis, utilisez les options Modifier, Transformer, Déformer et déplacer les coins individuellement pour qu’ils correspondent aux repères anatomiques. Définissez le mode de fusion du calque supérieur sur superposition dans le panneau Calques pour faciliter l’alignement. Dans chaque section qui affiche le cortex du canon, utilisez un stéréomicroscope pour identifier le canon sélectionné et découpez-le avec le canon adjacent à l’aide d’une lame de rasoir. Après avoir intégré la section dans un bloc de résine, collectez les sections ultra-minces sur des grilles en nickel à fente unique revêtues de Formvar. Après avoir aligné la pile d’images TEM comme illustré précédemment, définissez la zone d’analyse. Cliquez sur Calque, puis sur Nouveau et Calque, puis cliquez sur OK. Sélectionnez l’outil Rectangle, allez dans Calque, Style de calque, Trait. Définissez la couleur, l’épaisseur et la position du trait sur l’intérieur, puis cliquez sur OK. Maintenant, dessinez un rectangle pour définir la limite de l’analyse, puis sélectionnez Remplir 0 %. Pour ajouter un nouveau calque pour les annotations, sélectionnez Calque, Nouveau, Calque, puis cliquez sur OK. Utilisez l’outil Pinceau pour marquer les synapses sur ce calque. Utilisez l’outil Zoom et l’outil Main pour garantir la précision lors de l’annotation. Maintenant, ouvrez la pile d’images destinée à la reconstruction 3D. Sélectionnez l’outil Recadrage, marquez la zone contenant la colonne dendritique sur la pile, puis appuyez sur Entrée pour recadrer cette région dans toutes les couches visibles. Pour ne rendre visible qu’un seul calque à la fois, basculez l’icône en forme d’œil dans le panneau Calques. Cliquez sur Fichier, Enregistrer sous, nommez le fichier, sélectionnez le format JPG, puis cliquez sur OK pour enregistrer chaque image recadrée séparément. Ouvrez le logiciel de reconstruction 3D. Avant de télécharger, cliquez sur Z sur le gizmo de navigation ou appuyez sur le pavé numérique 7 pour aligner la perspective de la fenêtre d’affichage. Ensuite, pour télécharger les images, cliquez sur Ajouter, Image, Référence, puis sélectionnez la première image et double-cliquez pour confirmer. Pour positionner l’image finale de la GDT le long de l’axe z, cliquez sur l’image. Dans le panneau Propriétés de l’objet dans la barre latérale droite, entrez la valeur appropriée dans le champ Emplacement Z. Pour répartir toutes les images uniformément le long de l’axe z, sélectionnez tous les objets image. Appuyez sur Fin pour ouvrir le panneau Fin. Accédez à l’onglet Modifier et cliquez sur Répartir Z pour les espacer automatiquement en fonction de l’épaisseur de la section. Pour tracer manuellement la forme de la colonne dendritique sur chaque image TEM à l’aide d’une seule courbe par image, cliquez sur Ajouter, Courbe et Cercle. Pour déplacer le cercle, maintenez g enfoncé, faites glisser la souris, puis cliquez pour confirmer le placement. Maintenez s pour ajuster la taille, puis cliquez pour confirmer. Ensuite, mettez l’objet à l’échelle pour l’aligner sur la forme de l’épine dendritique. Maintenant, modifiez la forme incurvée pour l’adapter à la limite de la colonne vertébrale. Sélectionnez un point de contrôle, appuyez sur g, déplacez le point et cliquez pour confirmer. Utilisez les touches g ou s au besoin pour ajuster les points de poignée, en affinant la direction et l’intensité de la courbe. Pour ajouter plus de détails, maintenez la touche Maj enfoncée et sélectionnez deux points de contrôle voisins. Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Subdiviser pour insérer un nouveau point entre eux. Une fois que la courbe dessine avec précision le dos, entrez dans l’onglet Disposition, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’objet Cercle de Bézier et choisissez Dupliquer l’objet sans déplacer la souris. Pour relier les arêtes de l’objet joint et former un maillage fermé, entrez dans l’onglet Modélisation. Appuyez sur 2 pour passer en mode Edge Select. Cliquez sur Sélectionner, Tout, cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Boucles de bord de pont pour lier les anneaux de bord entre eux. Pour combler l’espace en haut de l’objet, désélectionnez tout en cliquant en regard de celui-ci. Maintenez la touche Alt enfoncée et cliquez sur un bord du rebord supérieur pour sélectionner la boucle entière. Cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Extruder les arêtes, puis faites glisser le pointeur vers le haut le long de l’axe z. Maintenant, appuyez sur s, déplacez la souris vers l’intérieur pour réduire la nouvelle boucle, puis cliquez pour confirmer. Avec la boucle toujours sélectionnée, cliquez avec le bouton droit de la souris et choisissez Nouveau visage dans Bords. Pour lisser la structure finale, allez dans l’onglet Modificateurs dans la barre latérale droite. Cliquez sur Ajouter un modificateur, accédez à Générer, puis sélectionnez Surface de subdivision. Réglez la fenêtre d’affichage et les niveaux de rendu à un seul pour un lissage cohérent. Pour attribuer une couleur à des structures individuelles, sélectionnez l’objet souhaité. Ouvrez l’onglet Matériau dans la barre latérale droite, cliquez sur Nouveau et définissez la couleur de base. Sélectionnez l’objet lumière pour ajuster l’éclairage de la scène. Appuyez et maintenez g, déplacez la souris pour repositionner la lumière et cliquez pour confirmer son nouvel emplacement. Pour positionner la caméra pour le rendu, orientez la fenêtre d’affichage de manière à ce qu’elle fasse face à l’épine dendritique telle qu’elle devrait apparaître dans la sortie finale. Appuyez sur Ctrl + Alt + pavé numérique 0 pour aligner l’appareil photo sur la vue actuelle. Ajustez le cadre de l’appareil photo en le sélectionnant, en maintenant g et en le déplaçant pour affiner le cadrage. Le cortex somatosensoriel de la souris était identifiable même dans des sections cérébrales non colorées, et l’ensemble du champ de barils a pu être reconstruit à l’aide d’outils numériques malgré la distribution des barils individuels sur plusieurs sections. Des images TEM ultra-minces consécutives ont permis de classer de manière fiable les synapses en types excitateurs ou inhibiteurs sur la base de preuves visuelles en série. La reconstruction tridimensionnelle des épines dendritiques à partir de coupes en série a permis de visualiser la morphologie de l’épine, révélant différentes formes, telles que des épines minces, champignon, trapues et intermédiaires. Les formes de la colonne vertébrale ont été quantifiées sur la base de mesures, notamment la longueur de la colonne vertébrale, la longueur du cou et les diamètres de la colonne vertébrale, de la tête et du cou.