Production d’un système de particules semblable au virus SARS-CoV-2 pour étudier les cycles de vie viraux in vitro

Nous présentons un protocole in vitro optimisé pour produire des particules semblables au virus du SRAS-CoV-2 qui imitent étroitement le virus authentique. Cette approche permet d’étudier les mécanismes d’infection, d’assemblage et de sortie virales sans les contraintes de nécessiter un laboratoire de biosécurité de niveau 3.

Nos recherches sont axées sur la compréhension de la biologie du virus SARS-CoV-2 et tentent de trouver des médicaments, en particulier de la médecine chinoise contre le SARS-CoV-2. Toutes les études sur le virus vivant du SRAS-CoV-2 doivent être contrôlées dans un laboratoire de niveau de biosécurité trois. Et cette limitation expérimentale fait qu’une étude sur le SRAS-CoV-2 n’est réalisable que dans une poignée de vies. Le virus SARS-CoV-2 comme méthode pratique de l’étude sur le SRAS-CoV-2 possible sans limitation de laboratoire de niveau de biosécurité trois, et la liste sera une méthode très utile.

[Instructeur] Pour commencer, ensemencez environ 3 millions de cellules HEK-293T dans une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres de diamètre avec un milieu complet DMEM, complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant environ 24 heures. Vérifiez la fluidité cellulaire au microscope. Diluer 60 microlitres de PEI à partir d’une solution mère d’un milligramme par millilitre avec un milieu sans sérum pour atteindre un volume final de 200 microlitres. Maintenant, prenez 200 microlitres de milieu sans sérum et ajoutez-y 6,7 microgrammes de plasmide N, 10 microgrammes de plasmide Luc-T20, 0,016 microgramme de plasmide S et 3,3 microgrammes de plasmide M-IRES-E. Ajouter délicatement la solution de PEI diluée dans la solution contenant l’enrobage des plasmides pour les protéines de structure virale et incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes. C’est la solution de transfection. Déposez délicatement la solution de transfection sur les cellules HEK-293T et faites tourner doucement la plaque de culture tissulaire pour assurer un mélange complet. Remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu complet DMEM six heures après l’infection et incubez les cellules HEK-293T transfectées à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Prélever le surnageant des cellules HEK-293T infectées, qui contiennent des particules semblables au virus SARS-CoV-2. Filtrez le surnageant collecté à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre pour éliminer les débris cellulaires. Il s’agit du support SC2-VLP. Ensemencez 40 000 cellules HEK-293T avec une expression stable de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2, ou ACE2, et TMPRSS2 dans une plaque de 96 puits, et ajoutez 50 microlitres de milieu SC2-VLP. Incuber la plaque de culture tissulaire à 96 puits à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après l’incubation, retirez le milieu de chaque puits de la plaque à 96 puits et lavez une fois avec 100 microlitres de PBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Lysez les cellules HEK-293T ensemencées avec des cellules ACE2 TMPRSS2 avec 20 microlitres de tampon de lyse passive, et basculez doucement l’échantillon sur un agitateur orbital pendant 15 minutes à température ambiante. Faites tourner la plaque à 96 puits à 4 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’une centrifugeuse à microplaques réfrigérée, puis transférez immédiatement la plaque dans un bain de glace. Prenez 100 microlitres de tampon de dosage de luciférase reconstituée dans une nouvelle plaque blanche opaque de 96 puits, et ajoutez 20 microlitres de lysat dans chaque puits. Mélangez brièvement en pipetant de haut en bas deux à trois fois. Mesurez le signal de luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques. Ensuite, pour évaluer la composition du milieu SC2-VLP, ajoutez 1,36 millilitre de solution PEG 8000 à 10 millilitres de milieu SC2-VLP. Placez le mélange sur un agitateur orbital et mélangez lentement à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Centrifugez la solution à quatre degrés Celsius et 2 000 G pendant 30 minutes. Et récupérez la pastille SC2-VLP pour l’analyse par western blot. Ensemencez uniformément environ 3 millions de cellules HEK-293T dans une boîte de culture à fond de verre de 15 millimètres de diamètre, et laissez les cellules adhérer et se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 70 % de confluence. Après avoir transecté les cellules comme démontré précédemment avec les quantités de plasmide modifiées, lavez doucement la boîte de culture deux fois avec un millilitre de PBS glacé. Ajouter un millilitre de solution de fixation d’aldéhyde paraforme à 4 % à température ambiante et incuber pendant 15 minutes. Lavez les cellules deux fois pendant cinq minutes chacune avec un millilitre de PBS à température ambiante, et perméabilisez les cellules en ajoutant un millilitre de Triton X-100 à 0,25 % pendant 10 minutes. Encore une fois, lavez les cellules deux fois pendant cinq minutes chacune avec un millilitre de PBS à température ambiante. Ajoutez ensuite un millilitre d’albumine sérique bovine à 5 % pendant une heure pour bloquer les interactions d’anticorps non spécifiques. Ajoutez environ 200 microlitres de solution d’anticorps primaires pour couvrir le fond du verre et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, retirez la solution d’anticorps primaire et lavez les cellules trois fois pendant cinq minutes chacune avec un millilitre de PBS à température ambiante. Maintenant, ajoutez une solution d’anticorps secondaires conjuguée à la fluorescence et incubez à température ambiante pendant une heure. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS, colorez les noyaux avec 2,5 microgrammes par millilitre de solution Hoechst à température ambiante pendant cinq minutes. Enfin, après avoir lavé les cellules avec du PBS, observez la coloration de la protéine S ou des organites avant d’acquérir des images à l’aide d’un microscope confocal. Cette figure illustre la sensibilité de la production de SC2-VLP à différentes quantités de transfection du plasmide codant pour la protéine de pointe. Le titre SC2-VLP était le plus élevé lorsque 0,016 microgramme de plasmide S était transfecté et diminuait significativement avec 0,16 et 1,6 microgramme de plasmide S. La mutation H1271 à E dans la protéine spike a significativement réduit le titre SC2-VLP par rapport au type sauvage. La mutation E1262 à H a conduit à une réduction modérée du titre SC2-VLP, tandis que la double mutation E1262 à H, H1271 à E a complètement aboli la production. Les bandes protéiques S et S-2 de pleine longueur ont été réduites dans les voies E1262 à H et double mutant, par rapport au type sauvage. L’efficacité de l’emballage S a également été réduite chez les mutants E1262 à H et H1271 à E et presque abolie chez le double mutant. L’abondance des VLP est restée largement inchangée chez les mutants de type sauvage et chez tous les mutants S. Protéine S de type sauvage colocalisée avec le marqueur cis-Golgi GM130, mais pas avec le marqueur ER Sec61 bêta ou le marqueur ERGIC ERGIC 53. La protéine S du mutant H1271 à E présentait une distribution cytoplasmique diffuse et manquait de colocalisation avec GM130.