Guide par étapes pour l’isolement et l’analyse de la surface des feuilles et de l’ARN apoplasique à l’aide de rosettes d’Arabidopsis

Nous essayons de comprendre comment les plantes régulent leur microbiome et si les ARN sécrétés par les plantes régulent l’expression des gènes chez les microbes procaryotes et eucaryotes qui colonisent les plantes. Nous utilisons une combinaison d’électrophorèse de coquille à haute résolution et d’analyse basée sur Illumina pour évaluer les ARN présents à la surface des feuilles et comment ils changent en réponse au stress biotique. Bien que des études récentes suggèrent que les ARN extracellulaires sont absorbés par des agents pathogènes fongiques et bactériens, les mécanismes sous-jacents de l’absorption de l’ARN et les conséquences fonctionnelles de cette absorption restent largement inexplorés.

Pour commencer, prenez des plants d’arabidopsis âgés de six à sept semaines pour chaque répétition. Ajoutez silhouette L-77 au VIB stérile, avant de commencer l’isolement du lavage de la surface des feuilles. Ensuite, à l’aide d’un cylindre mesureur, transférez 100 millilitres de la solution VIB préparée dans un flacon pulvérisateur de 500 millilitres.

À l’aide de ciseaux fins, détachez soigneusement les rosettes d’arabidopsis de leurs racines. Après cela, utilisez une brosse douce pour enlever tout excès de terre des pétales. Placez les rosettes détachées sur un plateau plat avec la surface abaxiale vers le haut.

Vaporisez ensuite la surface abaxiale à l’aide de cinq pompes du flacon pulvérisateur rempli de VIB et d’agent mouillant. Retournez délicatement les rosaces et vaporisez la surface adaxiale. Préparez des seringues modifiées avec des trous au fond en les enroulant avec un film para autour du goulot pour suspendre l’embout au-dessus du fond de la bouteille.

Pour récupérer le lavage de la surface des feuilles, insérez doucement les rosettes pulvérisées dans les seringues modifiées sans aiguille de 60 millilitres placées à l’intérieur des flacons de centrifugeuse de 250 millilitres, et vaporisez deux pompes fermes de tampon dans la seringue. Ensuite, centrifugez les bouteilles chargées à 100 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Filtrez maintenant le lavage de surface des feuilles récupéré à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre et recueillez le filtrat dans un tube à centrifuger de 50 millilitres, conservé sur de la glace.

Pour la méthode de l’écouvillonnage de la surface des feuilles, vaporisez les rosettes détachées avec le VIB et la solution d’agent mouillant de la même manière que décrite à l’étape précédente. Pour récupérer l’écouvillon de la surface des feuilles, utilisez des bâtonnets de coton stériles pour écouvillonner les surfaces adaxiale et abaxiale des rosettes. Appuyez ensuite les pointes trempées contre la paroi intérieure d’un tube à centrifuger de 15 millilitres pour extraire le liquide.

Filtrez l’échantillon d’écouvillon de surface de la feuille extrait, à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre dans un tube de deux millilitres placé sur de la glace. Placez le même ensemble de plantes précédemment utilisé pour le lavage de la surface des feuilles ou l’isolement des écouvillons dans un bécher propre et rincez-les doucement deux fois à l’eau distillée. Pour infiltrer sous vide les rosaces avec du VIB, placez soigneusement les rosettes rincées dans une cafetière à piston contenant 300 à 500 millilitres de VIB.

Fixez le couvercle et abaissez doucement le piston jusqu’à ce que les rosettes soient complètement immergées. Insérez la presse française dans une chambre à vide et appliquez un vide pendant 20 secondes à l’aide d’une pompe à vide jusqu’à ce que les plantes soient bien infiltrées. Après avoir relâché le vide, retirez la presse française de la chambre et retirez le couvercle.

Versez le VIB dans un bécher en plastique de 500 millilitres et retirez les rosettes. Ensuite, secouez doucement les rosettes et badigeonnez les feuilles sur une serviette en papier pour enlever l’excès de tampon. Maintenant, à l’aide de papier buvard, épongez doucement les surfaces des feuilles pour éliminer tout tampon restant.

Pour recueillir le liquide de lavage aplasique, insérez les rosettes infiltrées de VIB dans des seringues sans aiguille de 60 millilitres, placées à l’intérieur de flacons de centrifugeuse de 250 millilitres comme fait précédemment. Centrifugez les flacons à 600 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec une accélération lente. Filtrez ensuite le liquide de lavage aplastic accumulé à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre dans un tube de 15 millilitres placé sur de la glace.

Préparez ou achetez un mini-gel contenant 10 ou 15 % de polyacrylamide et sept molaires d’urée dans un tampon EDTA d’acide trisborique, en utilisant une solution d’acrylamide et de bis. Mélangez ensuite les échantillons d’ARN avec deux fois le tampon de charge dénaturant. Chauffez le mélange à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes et placez-le immédiatement sur de la glace.

Résolvez maintenant les échantillons d’ARN dans 0,5 fois le tampon de fonctionnement TBE à température ambiante en appliquant 220 volts pendant environ une heure et 15 minutes. Ensuite, colorez le gel avec du gel d’acide nucléique cyber gold en 0,5 fois TBE pendant 10 minutes. Rincez deux fois le gel à l’eau distillée et imagez-le à l’aide d’un système d’imagerie.

Pour quantifier les bandes d’ARN résolues, utilisez la méthode d’analyse sur gel de la documentation Image J sous le menu d’analyse et d’analyse de gel. Préparer des étalons d’ARN pour deux réplicats techniques en diluant l’ARN lysat cellulaire dans de l’eau libre de RNase et de DNase. Pour préparer une coloration au gel d’acide nucléique cyber gold 1,5 fois, dissolvez-la dans un tampon HCL tris de 500 millimolaires à pH huit.

Pour la mise en place de la microplaque, ajoutez 99 microlitres d’eau distillée dans chaque puits. Ensuite, ajoutez un microlitre d’ARN dans chaque puits en utilisant le même volume pour les échantillons d’ARN et les étalons. Enfin, ajoutez 50 microlitres de solution cyber gold dans chaque puits.

Pour régler les paramètres du lecteur de microplaques, choisissez l’agitation linéaire ou orbitale pendant trois secondes. Réglez le lecteur de microplaques sur le mode point final de fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 496 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 540 nanomètres. Construisez une ligne d’étalonnage en utilisant les valeurs d’intensité de fluorescence des étalons d’ARN.

L’analyse dénaturante du gel d’ARN a révélé que les échantillons de lavage de la surface des feuilles et de liquide de lavage aplasique contiennent une large gamme de tailles d’ARN, y compris des espèces d’ARN longues et petites. Les quantités totales d’ARN isolées du liquide de lavage aplasique et du lavage de la surface des feuilles étaient similaires, lorsqu’elles étaient normalisées en fonction du poids frais de la plante. Les profils d’ARN du lavage de la surface des feuilles, du lavage aplasique et du lysat cellulaire diffèrent considérablement, confirmant une contamination minimale par l’ARN intracellulaire et montrant que l’ARN aplasique est hautement traité avec des bandes diffuses de faible poids moléculaire L’ajout de 0,001 % de L-77 silhouette au tampon d’isolement de la vésicule a presque doublé le rendement en ARN des surfaces des feuilles par rapport au tampon sans agent mouillant.

Mais l’augmentation de cette concentration à 0,01 % n’a pas encore amélioré la récupération de l’ARN. Un deuxième lavage des mêmes feuilles a permis de récupérer environ 63 % de l’ARN obtenu lors du premier lavage, ce qui indique une sécrétion continue d’ARN à la surface des feuilles. La quantification de l’ARN, à l’aide de tests de microtitration sur plaque basés sur la fluorescence, a démontré une linéarité élevée avec la concentration d’ARN pour les méthodes de détection cyber gold et RIBO 488.

Nous avons montré que l’ARNt et les fragments dérivés de l’ARNt, ou TDR, sont particulièrement abondants dans l’ARN extracellulaire, probablement en raison de leur résistance à la dégradation. Nous pensons donc que ces TDR régulent probablement l’expression des gènes chez les bactéries. Nous souhaitons identifier les sources cellulaires de l’ARN de surface des feuilles et les rôles biologiques que cette RNase de surface des feuilles pourrait jouer dans le contexte d’interactions microbiennes planifiées.