Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie et des interactions avec les synapses dans la rétine murine malade

Le champ d’action de notre laboratoire est d’étudier les mécanismes sous-jacents du glaucome et de la microglie dans le remodelage des synapses pendant le développement. Les défis expérimentaux actuels portent sur la question de savoir si la microglie désassemble activement les synapses des cellules ganglionnaires rétiniennes ou s’il s’agit simplement d’éliminer passivement les débris. Commencez par la rétine de souris placée sur un papier filtre et séchez avec une lingette de laboratoire.

Inversez la rétine sur une boîte de Pétri MatTek. Alourdissez la rétine avec des billes métalliques ou un anneau. Ensuite, ajoutez trois à cinq gouttes de liquide cérébro-rachidien artificiel.

Placez l’échantillon sous un microscope confocal à disque rotatif et ajustez les réglages pour prévisualiser la rétine. Collectez des images le long de l’axe Z à une profondeur totale de 10 à 20 micromètres en utilisant une taille de pas de 0,3 micromètre. Maintenez l’intervalle de temps entre les images entre 20 à 30 secondes pour permettre un suivi cellulaire fiable.

Pour effectuer le rendu de surface des microglies, convertissez le fichier en laps de temps en format IMS à l’aide du logiciel de conversion de fichiers. Entrez les tailles des voxels en fonction des propriétés d’image acquises précédemment. Dans le domaine des logiciels d’analyse, cliquez sur le dossier observe pour ouvrir le fichier converti et vous assurer que l’image est en vue 3D.

Pour détecter des microglies individuelles, cliquez sur l’icône ajouter une nouvelle surface dans la barre d’objets (object toolbar). Sélectionnez un segment uniquement une région d’intérêt, suivez les surfaces dans le temps, classez les surfaces et les statistiques objet-objet dans les paramètres de l’algorithme. Ensuite, cliquez sur le bouton lecture bleu pour continuer.

Choisissez le canal pour le rendu de surface. Optionnellement, activez le lisse pour lisser la création de surface et entrer dans le détail de surface. Sous seuil, choisissez segmentation par apprentissage automatique pour détecter les cellules.

Dans la section données d’entraînement, utilisez les outils de pinceau en arrière-plan et au premier plan. Dessinez les coups de pinceau en sélectionnant le pinceau désiré et en utilisant la touche majus plus le clic gauche. Assurez-vous que l’affichage interpolé est activé, puis sélectionnez train et prédit.

Utilisez le pointeur jaune au centre pour naviguer sur l’axe Z. Tracez plusieurs traits sur les plans X, Y et Z, et sur plusieurs périodes. Utilisez trois à cinq coups courts par entrée, en ajustant de manière itérative jusqu’à obtenir une surface précise.

Utilisez le rectangle jaune pour basculer entre l’affichage d’entraînement et la surface réelle créée comme dernier test. Vérifiez également au fil du temps que la surface correspond à la morphologie cellulaire. Une fois terminé, désélectionnez les objets séparés.

Ajustez le seuil d’histogramme voxel pour éliminer les petits objets non connectés qui ne font pas partie de la surface primaire. Ensuite, modifie manuellement la surface pour enlever les objets superflus ou couper les bords avec l’outil ciseaux. Si désiré, fixez un seuil des espaces autorisés pour l’objet et sélectionnez l’algorithme de suivi pour la cellule mobile.

Filtrez les objets non associés à la surface principale. Une fois terminé, réglez l’affichage des cellules mobiles sur un profil transparent pour visualiser les points des étapes suivantes. Pour détecter un point PSD95 individuel, cliquez sur l’icône de surface bleue dans la barre d’objets à l’objet.

Ensuite, sélectionnez les emplacements de piste au fil du temps, classez les spots, et statistiques objet-objet, puis appuyez sur lecture. Sélectionnez le canal source du marqueur synaptique. Désactivez le slicer et les autres canaux pour visualiser uniquement le PSD95.

Utilisez le bouton de contrôle et l’outil de sélection de pointeurs pour estimer le diamètre XY du puncta. Choisissez quelques points lumineux qui persistent sur les images et désactivez la soustraction de fond. Ensuite, ajoutez un filtre basé sur la qualité des spots.

Ajustez l’histogramme pour inclure des points PSD95 précis sur toutes les périodes. Supprimez les taches de faux positifs via la modification. Basculez entre le curseur cube ou cercle pour supprimer les zones ne durant qu’une ou deux images.

Si désiré, fixez un seuil d’espaces autorisés et choisissez l’algorithme de suivi pour les taches synaptiques. Les traces de points de filtrage non associées à de puncta réels utilisent un seuil d’histogramme pour exclure les traces de petits objets. Définissez les classifications en utilisant la distance la plus courte par rapport à la classification de surface.

Englobé comme tout point inférieur à zéro micromètre, contacté approximativement entre zéro et 0,5 micromètre de la surface, et non contacté comme plus de 0,5 micromètre. Attribuez des étiquettes aux événements en utilisant les classifications ci-dessus. Une fois que les surfaces et taches représentent correctement la microglie et les points, exportez toutes les statistiques sous l’onglet statistiques.

La microglie a montré une longueur de déplacement du processus accrue après une hypertension oculaire induite par laser par rapport au témoin. La vitesse de microglie était significativement plus élevée dans les yeux traités au laser que chez les témoins. Le nombre d’événements de contact entre la microglie et le point PSD95 a augmenté après le traitement au laser.

Les enregistrements en accéléré ont montré que les rétines traitées au laser présentaient une motilité microgliale plus élevée et des interactions accrues avec les points PSD95 comparées aux rétines témoins. Nos résultats significatifs ont montré une augmentation du nombre de microglies, de la complexité et de la motilité, ainsi que la colocalisation synaptique après une élévation transitoire de la pression intraoculaire chez la souris. Notre protocole propose l’imagerie ex vivo, ce qui aide à éviter les problèmes d’opacité de la cataracte et de la cornée, permettant une installation plus facile pour des expériences plus rapides et un débit global plus élevé.

Nos résultats font progresser la recherche en permettant la visualisation des interactions microglie-neurone, de la communication cellulaire et de la dynamique à l’aide de lignes fluorescentes transgéniques, ainsi que de l’imagerie en accéléré à haute résolution.