Mesure de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dans les tissus solides à l’aide d’un test immuno-enzymatique compétitif (ELISA)

Le laboratoire Dechter étudie le métabolisme de l’oxyde nitrique. L’oxyde nitrique stimule la formation cyclique de GMP par une cascade d’homéostasie adaptative. Notre objectif est d’apprendre comment le vieillissement, l’alimentation et d’autres facteurs affectent cette cascade. Les recherches antérieures se concentrent sur la formation de l’oxyde nitrique et les effets physiologiques qui en résultent sur la négligence de la cascade reliant les deux. Notre protocole mesure la GMP cyclique, deuxième messager dans la cascade. Notre protocole est simple, accessible et facilement adaptable à divers types de tissus.

[Narrateur] Pour commencer,

Placez un pulvérisateur de mouchoirs, une pince à épiler et une cuillère sur de la glace sèche pendant 10 minutes. Pesez un excès de tissu porcin pour tenir compte des pertes lors de la pulvérisation. Transférez le tissu dans le pulvérisateur réfrigéré placé sur de la glace sèche. Congelez instantanément le tissu en versant de l’azote liquide dans le pulvérisateur et laissez-le se vaporiser complètement avant de continuer. Remettez ensuite le couvercle du pulvérisateur et frappez-le 15 fois à l’aide d’un maillet. Maintenant, tarez un tube d’homogénéisation de billes sur une balance. À l’aide de la cuillère réfrigérée et de la pince à épiler, transférez le tissu pulvérisé dans le tube. Pipetez de l’acide chlorhydrique normal 0,1 dans le tube d’homogénéisation, en veillant à ce que le volume en microlitres soit un multiple de la masse tissulaire en milligrammes. Ensuite, homogénéisez l’échantillon de tissu à l’aide d’un homogénéisateur de broyeur à billes. Centrifugez l’homogénat à 17 000 g pendant 30 minutes, tout en maintenant une température d’échantillon de quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant obtenu dans un tube de microcentrifugation. Centrifugez à nouveau pendant 10 minutes, tout en maintenant une température d’échantillon de quatre degrés Celsius. Pipetez une aliquote du surnageant final dans un tube de microcentrifugation et placez-la sur de la glace. Ensuite, pipetez 9,9 millilitres de tampon ELISA dans un tube étiqueté Standard B. Pipetez 100 microlitres de solution mère standard dans le tube standard B. Tourbillonnez à fond pour assurer une suspension uniforme. Transférez 1 000 microlitres de la solution de l’étalon B vers le tube étiqueté étalon 1. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon ELISA dans les tubes étiquetés Standard 0 et Standards 2 à 8. Norme Vortex 1. Transférez ensuite 500 microlitres de la solution dans le Standard 2. Ensuite, vortex Standard 2, et transférez 500 microlitres de la solution dans l’étalon 3. Continuez à transférer 500 microlitres de chaque étalon précédent dans le suivant, en tourbillonnant complètement après chaque édition jusqu’à ce que le standard 8 soit préparé. Pour l’acétylation des échantillons, ajouter 50 microlitres d’hydroxyde de potassium à quatre molaires à une aliquote d’échantillon de 250 microlitres. Ajouter immédiatement 12,5 microlitres d’anhydride acétique. Agitez la solution pendant 15 secondes. Ensuite, pipetez 12,5 microlitres de quatre molaires d’hydroxyde de potassium et de vortex à nouveau. Dans le tube étiqueté Standard 0, ajoutez 100 microlitres d’hydroxyde de potassium à quatre molaires, suivis immédiatement de 25 microlitres d’anhydride acétique. Après le vortex, pipetez 25 microlitres de quatre molaires d’hydroxyde de potassium dans le tube et vortex brièvement. Répétez les ajouts d’hydroxyde de potassium et d’anhydride acétique, suivis d’un vortex pour les étalons restants, ajoutez un rapport prédéterminé de tampon ELISA et d’aliquote d’échantillon acétylé dans un tube de microcentrifugation. Vortex Standard 0. Transférez des aliquotes de 50 microlitres de la norme 0 vers cinq puits désignés comme puits NSB et puits B zéro de la microplaque ELISA. Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon ELISA dans les deux puits NSB contenant le standard 0. À l’aide d’une seule pointe de pipette, ajoutez des aliquotes de 50 microlitres des étalons 1 à 8 dans des puits en double, en commençant par la norme 8 et en continuant jusqu’à la norme 1. Vortex chaque échantillon. Ajoutez ensuite 50 microlitres dans les puits appropriés en double ou en triple. Maintenant, pipetez 50 microlitres de traceur d’acétylcholinestérase à tous les puits désignés comme NSB, B zéro, standard et échantillon. Ajoutez 50 microlitres d’antisérum à chaque B zéro, étalon et échantillonnez bien. Couvrez la plaque ELISA et incubez à quatre degrés Celsius pendant 18 heures. Après l’incubation, retournez la plaque ELISA au-dessus d’un conteneur à déchets pour éliminer le contenu. Remplissez les puits avec un tampon de lavage à l’aide d’une bouteille de lavage. Agitez doucement pendant cinq secondes. Versez ensuite le tampon de lavage et tapotez le liquide restant sur une serviette en papier. Maintenant, transférez le réactif d’Ellman dans un réservoir. Pour travailler rapidement, utilisez une pipette multicanaux pour ajouter 200 microlitres de réactif d’Ellman dans les puits à blanc, NSB, B zéro, TA, standard et d’échantillon. Ajoutez cinq microlitres de traceur d’acétylcholinestérase dans le puits TA. Couvrez ensuite la plaque ELISA avec du Parafilm. Placez-le dans un récipient protégé de la lumière pour l’incuber à température ambiante avec agitation pendant 60 à 90 minutes. Retirez le parafilm et lisez la densité optique à 412 nanomètres La concentration cyclique de GMP dans le foie porcin dans le groupe témoin était d’environ 0,0202 nanomoles par gramme de tissu. Dans le groupe traité au nitrate, la concentration cyclique de GMP a augmenté à environ 0,0364 nanomole par gramme de tissu.