Développement d’un dispositif d’éclairage LED innovant pour l’application in vitro de la thérapie photodynamique avec Rose Bengal

Le champ de nos recherches est de développer des projets fondamentaux et translationnels visant à caractériser l’effet de la thérapie photodynamique dans le traitement du cancer sans options thérapeutiques efficaces. Les défis expérimentaux actuels consistent à développer les technologies nécessaires à la mise en œuvre de la thérapie photodynamique de l’in vitro à l’application clinique, y compris de nouveaux photosensibilisants et de nouveaux dispositifs d’éclairage. Par rapport à d’autres techniques, notre protocole implique un dispositif peu coûteux et fait maison, permettant un éclairage plus généreux d’une plaque de 96 puits et de l’état physiologique à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire.

Pour commencer, retirez les cellules d’HepG2 cultivées de l’incubateur et placez le flacon sous le poste de sécurité microbiologique prénettoyé. À l’aide d’une pipette, retirer le milieu de culture de la fiole de culture. Pour éliminer le milieu résiduel, rincez avec une solution tamponnée au phosphate tout en mélangeant délicatement, puis retirez soigneusement le tampon.

Ensuite, appliquez trois millilitres de solution de trypsine contenant 0,25 % de trypsine et 0,53 millimolaire d’EDTA sur les cellules et remettez la culture dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour détacher les cellules. Au bout de cinq minutes, ajoutez sept millilitres de milieu de culture dans le ballon pour neutraliser la trypsine et suspendre les cellules. Maintenant, transférez la trypsine, le milieu et les cellules détachées dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Pour compter les cellules, pipetez 20 microlitres de la solution cellulaire dans un tube propre et ajoutez 20 microlitres de solution de bleu de trypan. Après avoir mélangé, chargez le mélange coloré sur la lame de comptage et insérez-le dans le compteur de cellule. Ensuite, ajoutez du milieu de culture dans un tube, puis introduisez des cellules pour atteindre une concentration finale de 150 000 cellules par millilitre.

Grainez 1,5 fois 10 à la puissance quatre cellules par puits dans une plaque blanche de 96 puits à fond clair et plat. Préparez deux planches pour chaque temps de lecture de viabilité. Incuber les plaques pendant 24 heures avant le traitement pour permettre aux cellules de se fixer.

Pour préparer une solution mère de rose de Bengale, dissolvez-la dans une solution saline à 10 %. Diluer les solutions de traitement au bengale de rose à des concentrations allant de zéro à 100 micromolaires dans un milieu de culture cellulaire. Maintenant, retirez le milieu de culture des plaques cellulaires et ajoutez 100 microlitres des solutions de traitement de rose bengale préparées dans chaque puits.

Incuber les cellules avec de la rose bengale pendant deux heures pour permettre l’internalisation. Après deux heures, retirez la solution de rose de Bengale de chaque puits, lavez les cellules deux fois avec du PBS, aspirez le PBS et ajoutez 100 microlitres par puits de milieu de culture sans rose de Bengale. Couvrez les microplaques d’une feuille d’aluminium pour les protéger de la lumière et réservez la moitié des plaques pour l’éclairage pendant le test de thérapie photodynamique.

Connectez le connecteur mâle du distributeur de lumière au connecteur femelle de la source lumineuse. Retirez la thérapie photodynamique et les microplaques d’état sombre de l’incubateur. Déballez la plaque de thérapie photodynamique.

Ensuite, réglez le variateur du pilote LED au niveau maximum pour fournir une irradiance moyenne de 0,62 milliwatt par centimètre carré à travers les 96 puits. Après cela, placez la plaque sur le distributeur de lumière. Illuminez la microplaque jusqu’à ce que la dose de lumière souhaitée sur les cellules soit atteinte.

Une fois la dose de lumière souhaitée atteinte, éteignez l’appareil. Enroulez à nouveau la microplaque de thérapie photodynamique dans une feuille d’aluminium et retournez-la avec la plaque de contrôle dans l’incubateur jusqu’à ce que le test de viabilité soit effectué. Après avoir terminé le test de thérapie photodynamique, placez la plaque éclairée dans l’incubateur pendant 24 heures pour permettre la réponse cellulaire post-traitement.

Après la période d’incubation, récupérez une plaque lumineuse et une plaque non lumineuse. Ajoutez 100 microlitres de réactif du kit de test de viabilité cellulaire dans chaque puits pour mesurer le métabolisme mitochondrial et la production d’ATP. Incuber les plaques dans l’obscurité pendant 10 minutes avant de procéder à la mesure de la luminescence.

Après 10 minutes, lisez la luminescence dans chaque puits à l’aide d’un lecteur multimodal. Considérons que la luminescence des puits de contrôle non traités représente une viabilité de 100 %. Normalisez les valeurs de luminescence des puits traités à ce contrôle pour calculer le pourcentage de viabilité pour chaque condition de traitement.

Répétez le même protocole pour la mesure de la viabilité cellulaire à d’autres points de temps post-traitement, tels que 24 heures, 48 heures et 72 heures. L’éclairage seul sans le bengale de rose n’a pas modifié la viabilité des cellules HepG2 à aucune des doses de lumière testées, et le bengale de rose seul sans lumière n’a également causé de changement significatif dans toutes les concentrations. La thérapie photodynamique médiée par le bengale de rose à l’aide de CELL-LED-550/3 a considérablement réduit la viabilité des cellules HepG2 à toutes les doses légères, montrant un fort effet cytotoxique.

Le chevauchement entre le profil d’émission des LED et le spectre d’absorption du rose bengal a confirmé la compatibilité spectrale du dispositif CELL-LED-550/3 avec le photosensibilisateur. À l’avenir, l’un de nos principaux objectifs est de développer de nouveaux boîtiers PDT, chacun comprenant à la fois un composé photosensible permettant de cibler des cellules cancéreuses spécifiques et un dispositif d’éclairage associé.