Name: Ookluc : une ligne de Plasmodium berghei pour l’identification des composés bloquant la transmission (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Découvrez une méthode de criblage haut débit pour identifier les composés bloquant la transmission du Plasmodium en utilisant la lignée transgénique P. berghei Ookluc. Cette approche permet la détection automatisée du développement parasitaire post-fécondation et la détermination précise de l'IC50.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées en stricte conformité avec les directives éthiques et ont été approuvées par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux de l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de São Paulo (CEUA-ICB/USP). Les animaux ont été logés et entretenus dans le respect des normes établies par ce comité. Les expériences impliquant des parasites Plasmodium génétiquement modifiés, ainsi que leur stockage cryoconservé à -80 °C, ont été menées dans le respect de la réglementation établie par le Comité institutionnel de biosécurité de l’Institut des sciences biomédicales de l’Université de São Paulo (CIBio-ICB/USP). Au total, trois souris femelles BALB/c, âgées de 3 à 5 semaines, ont été utilisées dans cette étude - deux infectées et une non infectée.
1. Matériaux et réactifs
<ol>
	<li>Préparez le milieu d’ookinète en complétant RPMI 1640 avec 0,025 M HEPES, de la pénicilline-streptomycine-néomycine (PSN), 50 mg/L d’hypoxanthine et 100 μM d’acide xanthurénique. Ajustez le pH à 8,3, 8,16.</li>
	<li>Préparez la solution de travail pour l’essai de luminescence en mélangeant 1 volume de substrat avec 50 volumes du tampon de lyse fourni dans le système d’essai de luciférase.</li>
	<li>Réglez un incubateur à 21 °C.</li>
</ol>
2. Infection et prélèvement de sang parasité
<ol>
	<li>Infecter deux souris BALB/c femelles (âgées de 4 à 6 semaines) avec 150 μL de souche Ookluc cryoconservée par injection intrapéritonéale (jour 0). REMARQUE : Dans ce protocole, nous recommandons l’utilisation des souris BALB/c en raison de leur disponibilité immédiate et de leur utilisation répandue dans les animaleries. Cependant, toute souche de souris de type sauvage sensible à l’infection à P. berghei et favorisant la gamétocytogenèse devrait être adaptée à l’utilisation.</li>
	<li>À partir du jour 3, évaluer la parasitémie et la gamétocytémie par examen microscopique des frottis sanguins colorés à Giemsa.</li>
	<li>Lorsque la parasitémie et la gamétocytémie atteignent environ 5 % et 0,5 %, respectivement (généralement au jour 4), prélevez du sang par ponction cardiaque à l’aide de seringues héparinées et accumulez le sang des deux souris infectées. REMARQUE : Bien qu’il s’agisse d’une lignée transgénique de P. berghei, sa croissance et son profil de gamétocytémie sont similaires à ceux observés dans la souche ANKA. Dans ce contexte, la proportion de gamétocytes par rapport à la parasitémie totale est environ 10 fois plus faible. REMARQUE : Idéalement, la plaque composée (voir ci-dessous) est préparée avant le prélèvement du sang parasité, de sorte que le sang est pipeté sur la plaque immédiatement après le prélèvement. Si le sang de souris doit être prélevé dans une autre pièce ou s’il ne peut pas être immédiatement pipeté sur la plaque composée pour toute autre raison, le sang prélevé doit être conservé à 37 °C pendant 30 minutes au maximum.</li>
</ol>
3. Essai de conversion - criblage sur plaques de 96 puits
REMARQUE : Pour garantir des résultats cohérents, l’expérience entière doit être répétée trois fois à des jours différents pour confirmer les résultats.
<ol>
	<li>Préparez les échantillons de composés en utilisant un milieu d’ookinete comme diluant (une concentration finale de 10 μM). Diluer le composé à 1 mM et préparer les échantillons de travail en diluant le 1 mM 1:100 v :v dans le milieu Ookinete. Pour un essai en double, préparer un volume final de 200 μL d’échantillon de travail.</li>
	<li>Si le composé est dilué dans un solvant autre que l’eau, inclure un échantillon témoin contenant le solvant dilué dans un milieu ookinète dans la même proportion que dans l’échantillon d’essai pour s’assurer que toute inhibition observée est attribuable au composé et non au solvant. REMARQUE : À titre d’exemple, nous allons passer au crible 90 composés.</li>
	<li>À l’aide de deux plaques à 96 puits, placer 80 μL des échantillons dans chaque puits, comme suit et illustré à la figure 1, en double (deux plaques) : Contrôle positif : 80 μL de milieu ookinète ; Contrôle négatif : 80 μL de milieu d’ookinète ; Contrôle du solvant : 80 μL de milieu d’ookinete avec 1 % de DMSO ; Echantillons : 80 μL de 10 μM de chaque composé dans un milieu ookinète.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig1.jpg"> 
Figure 1 : Représentation schématique d’une disposition de plaque à 96 puits conçue pour le criblage composé. La disposition des plaques comprend un témoin positif (C+), un témoin négatif (C-), un témoin plus solvant de dilution (C+S) et 90 composés d’essai (S1-S90). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="4">
	<li>Ajouter 4 μL de sang de souris parasité dans chaque puits de la plaque à 96 puits selon un rapport v :v de 1:20, sauf pour le témoin négatif (C-). Homogénéiser doucement par pipetage. REMARQUE : En tenant compte des pertes, nous calculons le besoin de ~400 μL de sang parasité pour chaque plaque.</li>
	<li>Pour le contrôle négatif, ajoutez du sang de souris non infectée dans un rapport de 1:20 (v :v, sang :échantillon). Homogénéiser doucement.</li>
	<li>Incuber à 21 °C pendant 6 h ou 24 h. REMARQUE : l’activité de nLuc est détectable après 6 h d’incubation et atteint son maximum à 24 h après le test8. Le test n’est pas capable d’identifier les composés ayant une activité après la formation du zygote, comme les composés qui inhibent la morphogenèse des ookinètes, car les zygotes formés accumuleront nLuc indépendamment de la complétion de la morphogenèse. Par conséquent, une incubation de 6 heures est suffisante pour détecter tous les composés qui bloqueront l’activité de nLuc en inhibant la gamétogenèse, la recombinaison sexuelle ou la cytotoxicité précoce. Cependant, nous privilégions normalement les incubations de 24 h pour avoir des signaux plus forts et un meilleur rapport signal/bruit.</li>
</ol>
4. Dosage de la luminescence
<ol>
	<li>Après la période d’incubation, homogénéisez les échantillons en pipetant de haut en bas pour assurer un mélange complet du milieu sanguin.</li>
	<li>Préparez le mélange tampon de lyse/substrat de luciférase immédiatement avant l’utilisation dans un rapport de 1:50 (v :v, substrat :tampon de lyse).</li>
	<li>Mélangez le mélange de substrat avec des échantillons dans un rapport de 1:1 (v :v), en veillant à ce que le mélange soit doux pour éviter les bulles. Incuber à 37 °C pendant 3 à 5 min. REMARQUE : Dans cet exemple, nous avons ajouté 84 μL de tampon substrat :lyse à chaque puits.</li>
	<li>Transférez les échantillons sur une plaque blanche à fond plat de 96 puits. Mesurez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques. Utilisez la configuration des paramètres suivante : filtre d’émission : lentille ; temps d’intervalle de mesure : 1 s par puits.</li>
</ol>
5. Analyse des données - dépistage
<ol>
	<li>Après le test de luminescence, notez les données brutes qui apparaissent (Figure 2). REMARQUE : Les unités de lumière relatives (RLU) obtenues dépendent du luminomètre utilisé. Dans notre cas, les valeurs RLU pour le témoin positif variaient de 10 000 à 500 000 dans un essai d’incubation de 24 heures. Des temps d’incubation plus courts (6 h) entraîneront des valeurs RLU plus faibles.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig2.jpg"> 
Figure 2 : Résultats obtenus à partir d’une lecture simulée d’un test de conversion pour le criblage de composés. L’image montre des lectures de luminescence simulées à partir d’un test effectué après la conversion d’ookinètes en présence d’un panel de 90 composés. Des valeurs d’unité de lumière relative plus faibles indiquent une formation réduite d’ookinète. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="2">
	<li>À l’aide d’une feuille de calcul, calculez la moyenne de chaque mesure à l’aide de la formule ci-dessous. Remplacez XX par l’adresse de la première cellule de mesure et YY par l’adresse de la deuxième cellule de mesure. Répétez la formule pour tous les échantillons. =(MOYENNE(XX :YY)</li>
	<li>Convertissez les données en % d’inhibition pour une meilleure analyse des résultats. Dans la feuille de calcul, utilisez la formule ci-dessous. Remplacez A par la valeur RLU de l’échantillon et B par la valeur RLU de contrôle. Répétez la formule pour tous les composés testés : = 1 - (A/B) x 100 REMARQUE : Les données apparaîtront comme indiqué à la figure 3.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig3.jpg"> 
Figure 3 : Résultats obtenus à partir d’une lecture simulée d’un test de conversion pour le criblage de composés représentés en % d’inhibition pour chaque composé. Pourcentage d’inhibition de la conversion pour chaque composé testé, calculé comme décrit ci-dessus. Les carrés mis en évidence indiquent les composés qui favorisent une inhibition de la conversion de plus de 95 %. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="4">
	<li>Identifiez les composés qui présentent une inhibition supérieure à 95 %. REMARQUE : Ces composés présentent une activité élevée contre les stades sexuels à une concentration de 10 μM. Dans notre exemple, nous avons trouvé cinq composés à forte activité contre les stades sexuels.</li>
	<li>Pour les composés identifiés, effectuer une détermination IC50 comme décrit ci-dessous.</li>
</ol>
6. Essai de conversion - détermination de IC 50
<ol>
	<li>Infectez les souris avec Ookluc et collectez du sang parasité, comme décrit dans la rubrique 2.</li>
	<li>Préparez les échantillons en utilisant un milieu d’ookinete comme diluant. Utiliser une concentration initiale à laquelle une inhibition de 100 % de la conversion par le composé est observée. REMARQUE : Étant donné que les composés actifs ont été identifiés dans un crible avec une concentration de 10 μM, nous utilisons 20 μM comme concentration initiale pour la première courbe dose-réponse. Pour obtenir une courbe dose-réponse précise, il est important que votre test comprenne des concentrations initiales qui entraînent une inhibition de 100 % de la conversion et des concentrations finales qui conduisent à une inhibition de 0 %. Cette approche garantit un calcul précis de l’IC50 . La première courbe dose-réponse informera les concentrations les plus faibles du composé avec une inhibition de ~100 %. Dans ce protocole, nous utiliserons comme exemple PyAz90, récemment identifié à l’aide d’Ookluc13.</li>
	<li>Dans une plaque à 96 puits, ajouter en trois exemplaires (voir figure 4) : Contrôle positif (C+) : 80 μL de milieu d’ookinète ; Contrôle négatif (C-) : 80 μL de milieu d’ookinète ; Première dilution de l’échantillon (Cpd D1) : 160 μL de composé à une concentration initiale dans un milieu d’ookinète qui entraîne une inhibition de 100 % de la conversion ; Puits D2 à D12 : 80 μL de milieu ookinète.</li>
	<li>Faites des dilutions en série en deux en pipetant 80 μL du puits D1 dans D2, homogénéisez et pipetez 80 μL du puits D2 dans D3 et ainsi de suite. Assurez-vous que tous les puits ont un volume total de 80 μL, alors jetez les derniers 80 μL retirés du puits D12. REMARQUE : Effectuer l’expérience avec au moins trois répétitions pour tous les échantillons, comme indiqué à la figure 4. Pour garantir la fiabilité et la reproductibilité de vos résultats, l’ensemble de l’expérience doit être répété sur trois jours distincts en utilisant à chaque fois des animaux nouvellement infectés. REMARQUE : Si dans le premier tamis, les résultats ne montrent aucun impact du solvant dans la conversion, il n’est pas nécessaire d’inclure ces contrôles dans les dilutions en série. Sinon, les dilutions en série du solvant doivent également être incluses.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig4.jpg"> 
Figure 4 : Disposition de la plaque à 96 puits conçue pour la détermination de l’IC50 composé. La disposition des plaques comprend des dilutions de contrôle positif (C+), de contrôle négatif (C-) et de composés (Cpd) (D1 à D12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="5">
	<li>Ajoutez du sang de souris parasité à la plaque de 96 puits à une vitesse de 1:20 v :v. Homogénéiser doucement par pipetage. REMARQUE : Un total de 4 μL de sang parasité sera ajouté à chaque puits, à l’exception du témoin négatif (C-). En tenant compte des pertes, nous calculons le besoin de ~200 μL de sang parasité pour chaque composé à tester.</li>
	<li>Dans les puits de contrôle négatif, ajoutez du sang de souris non infectées dans un rapport de 1:20 (v :v, sang :échantillon). Homogénéiser doucement.</li>
	<li>Incuber à 21 °C pendant 6 h ou 24 h.</li>
	<li>Effectuez le test de luminescence, comme décrit dans la section 4.</li>
</ol>
7. Analyse des données - Détermination de l’IC 50
REMARQUE : La CI50 est définie comme la concentration d’un composé nécessaire pour inhiber 50 % de l’activité biologique/inhibition. Dans ce test, l’inhibition fait référence à la réduction de la conversion de l’ookinète. Les données sont représentées sous la forme d’une courbe dose-réponse sigmoïdale, où l’axe des X représente la concentration du composé (transformée en logarithm) et l’axe des Y représente le % d’inhibition.
<ol>
	<li>Calculer le % d’inhibition comme décrit à l’étape 5.3 de la section 5.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel et créez une table XY.</li>
	<li>Définissez les options de l’axe Y sur Entrez 3 valeurs de réplication dans des sous-colonnes côte à côte.</li>
	<li>Collez les données, X représentant la concentration du composé et Y représentant le % d’inhibition (figure 5A).</li>
	<li>Dans la barre de menus, cliquez sur Analyser et sélectionnez Régression non linéaire (ajustement de la courbe), puis Courbes dose-réponse - Inhibition et [inhibiteur] vs. réponse normalisée - pente variable ; cliquez sur OK.</li>
	<li>Dans le panneau de gauche, observez la courbe dose-réponse des données. Appliquez la personnalisation souhaitée, telle que les changements de couleur et les formats de points.</li>
	<li>Localisez le tableau d’ajustement de Nonlin pour trouver la CI50 calculée et l’intervalle de confiance à 95 % (IC à 95 %) (Figure 5B).</li>
</ol>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig5.jpg"> 
Figure 5 : Courbe dose-réponse de PyAz90. Le % d’inhibition a été mesuré en fonction de la concentration de PyAz90 (μM) sur une échelle logarithmique. La courbe sigmoïdale représente les données ajustées utilisées pour déterminer la CI50, qui était de 0,013 μM (intervalle de confiance à 95 % : 0,012-0,014 μM). Les points de données représentent la moyenne ± l’erreur-type de la moyenne des répétitions expérimentales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<ol><li>World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024">https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024</a> (2025).</li>
<li>Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+biology+and+disease+pathogenesis%3A+insights+for+new+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments.</a> Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).</li>
<li>Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Vaccines%3A+From+the+Past+towards+the+mRNA+Vaccine+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era.</a> Vaccines. 11 (9), 1452(2023).</li>
<li>Ménard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+under+the+skin%3A+the+first+steps+in+malarial+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity.</a> Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).</li>
<li>Appetecchia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-blocking+strategies+for+malaria+eradication%3A+Recent+advances+in+small-molecule+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development.</a> Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).</li>
<li>Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Plasmodium+falciparum+growth+assay+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).</li>
<li>Delves, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activities+of+current+antimalarial+drugs+on+the+life+cycle+stages+of+Plasmodium%3A+A+comparative+study+with+human+and+rodent+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites.</a> PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+pathogen+box+for+molecules+active+against+Plasmodium+sexual+stages+using+a+new+nanoluciferase-based+transgenic+line+of+P.+berghei+identifies+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+transmission-blocking+antimalarials+identified+by+high-throughput+screening+of+Plasmodium+berghei+Ookluc%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc.</a> Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).</li>
<li>Lima, M. N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+multi-kinase+approach+for+the+identification+of+potent+antiplasmodial+hits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits.</a> Front Chem. 7, 773(2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+chemogenomics+drug+repositioning+strategy+enables+the+discovery+of+epirubicin+as+a+new+repurposed+hit+for+Plasmodium+falciparum%C3%82%C2%A0and%C3%82%C2%A0P.+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparumÂ andÂ P. vivax.</a> Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).</li>
<li>Krishnan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torin+2+derivative%2C+NCATS-SM3710%2C+has+potent+multistage+antimalarial+activity+through+inhibition+of+P.+falciparum+phosphatidylinositol+4-kinase+%28Pf+ACS+Pharmacol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol).</a> Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+azepine+targets+the+Plasmodium+bc1+complex+and+displays+multistage+antimalarial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity.</a> JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).</li>
<li>Lima, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcones+as+a+basis+for+computer-aided+drug+design%3A+Innovative+approaches+to+tackle+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria.</a> Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4-aminoquinoline+chemotype+with+multistage+antimalarial+activity+and+lack+of+cross-resistance+with+PfCRT+and+PfMDR1+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants.</a> PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).</li>
<li>Blagborough, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+transmission+blockade+in+Plasmodium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing transmission blockade in Plasmodium spp.</a> Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).</li>
<li>Azevedo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+method+for+in+vitro+screening+of+Plasmodium+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).</li>
<li>Gaitán, X. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+merozoite+thrombospondin+related+anonymous+protein+%28MTRAP%29+of+Plasmodium+berghei+as+a+transmission-blocking+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism version 10.0.0 pour Windows</td><td></td><td></td><td>GraphPad Software, Boston, Massachusetts, États-Unis</td></tr><tr><td>Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N° H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N° H9636</td><td></td></tr><tr><td>Souris</td><td>---</td><td>---</td><td>Souris femelles BALB/c, âgées de 3 à 5 semaines</td></tr><tr><td>Système de dosage de la luciférase Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline et moins ; Streptomycine et moins ; Solution de néomycine stabilisée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. P4083</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques POLARStar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Moyen, Supplément GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>61870036</td><td></td></tr><tr><td>Acide xanthurénique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td></td></tr></tbody></table>

ookluc : une ligne de plasmodium berghei pour l’identification des composés bloquant la transmission

Ookluc: A Plasmodium berghei Line for Identifying Transmission-blocking Compounds

Ookluc : une ligne de Plasmodium berghei pour l’identification des composés bloquant la transmission

Malaria remains a world health challenge; in 2023, 263 million cases and 597,000 deaths were reported around the globe. The parasite's life cycle is ...

ookluc-plasmodium-berghei-line-for-identifying-transmission-blocking

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une fois qu'un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires au paludisme, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections à Plasmodium dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l'étendue des infections à Plasmodium de moustiques peuvent être dosés. Les techniques de préparation de la culture de gamétocytes, se nourrissant de sang humain membrane moustiques, et en dosant les titres viraux dans l'intestin moyen des moustiques sont démontrés.

Protocole pour les infections à Plasmodium falciparum dans la détermination Phénotype moustiques et les infections

Les moustiques transmettant le paludisme présentent un certain nombre de caractéristiques épidémiologiquement importantes qui ne peuvent être détectées qu’à l’aide de techniques moléculaires. À l’aide d’une plateforme de génotypage SNP basée sur MALDI-TOF, nous avons mis au point un test permettant de détecter simultanément plusieurs traits clés (espèce, résistance aux insecticides, infection parasitaire et choix de l’hôte) des vecteurs du paludisme.

Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme

Nous décrivons un modèle murin de paludisme cérébral expérimental et montrons comment la pathologie inflammatoire et microvasculaire peut être suivie in vivo à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique.

Le suivi in vivo du développement de l&#39;œdème et de la pathologie microvasculaire dans un modèle de paludisme cérébral expérimental utilisant l&#39;imagerie par résonance magnétique

En raison des similitudes frappantes entre le cycle de vie et la biologie des parasites du paludisme des rongeurs et les parasites du paludisme chez l'homme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ici, nous avons normalisé certaines des techniques les plus importantes utilisées dans l'analyse phénotypique des espèces de paludisme de rongeurs de type sauvage et transgénique.

Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

Des études détaillées sur les stades des moustiques des parasites du paludisme sont essentielles pour concevoir des stratégies efficaces de blocage de la transmission. Ce protocole montre comment mettre en culture efficacement des gamétocytes infectieux, puis nourrir ces gamétocytes avec des moustiques pour générer des stades de moustiques de P. falciparum.

Plasmodium falciparum Culture de gamétocytes et infection par les moustiques par l’alimentation par membrane artificielle

Utilisation du broyage par faisceau d’ions focalisés pour produire des lamelles vitreuses sur grille à partir d’échantillons biologiques congelés pour la cryotomographie électronique.

Préparation de lamelles à partir d’échantillons biologiques vitreux à l’aide d’un microscope électronique à balayage à double faisceau pour la cryotomographie électronique

Ce protocole décrit un test immuno-enzymatique sandwich pour détecter les sporozoïtes des glandes salivaires chez les moustiques. En utilisant des anticorps monoclonaux facilement disponibles, la méthode permet une détection rentable et à haut débit des moustiques porteurs de Plasmodium falciparum ou de Plasmodium vivax. La méthode convient à la recherche sur la transmission du paludisme, y compris les enquêtes vectorielles.

Détection de sporozoïtes de Plasmodium chez les anophèles à l’aide d’un test immuno-enzymatique

Le test standard d’alimentation membranaire (SMFA) est considéré comme l’étalon-or pour l’évaluation et l’identification de composés antipaludiques potentiels. Ce système d’alimentation artificiel est utilisé pour infecter les moustiques afin d’évaluer davantage les effets de ces composés sur l’intensité et la prévalence du parasite Plasmodium falciparum .

Dosage standard d’alimentation par membrane pour la détection de l’infection à Plasmodium falciparum chez les moustiques vecteurs anophèles

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour aider à élucider les mécanismes de l’immunité cellulaire à Plasmodium pendant le stade sanguin de l’infection. Il s’agit d’un test in vitro qui mesure la destruction des globules rouges infectés par les lymphocytes cytotoxiques.

In vitro Dosage de la destruction des globules rouges infectés par le plasmodium par des lymphocytes cytotoxiques

Le paludisme est transmis par l’inoculation du stade sporozoïte de Plasmodium par des moustiques infectés. Le plasmodium transgénique nous a permis de mieux comprendre la biologie du paludisme et a contribué directement aux efforts de développement d’un vaccin contre le paludisme. Nous décrivons ici une méthodologie simplifiée pour générer des sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei .

Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

La génétique chimique implique la substitution d’un résidu gardien par un acide aminé contenant une chaîne latérale différente au locus cible. Ici, nous avons généré un parasite mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 et identifié des voies compensatoires adoptées par le parasite dans le fond mutant.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Découvrez une méthode de criblage haut débit pour identifier les composés bloquant la transmission du Plasmodium en utilisant la lignée transgénique P. berghei Ookluc. Cette approche permet la détection automatisée du développement parasitaire post-fécondation et la détermination précise de l'IC50.

Ookluc : une ligne de Plasmodium berghei pour l’identification des composés bloquant la transmission

Explorer plus de vidéos