Ookluc : une ligne de Plasmodium berghei pour l’identification des composés bloquant la transmission

Notre recherche vise à identifier et à caractériser les composés bloquant la transmission et les gènes essentiels dans les stades sexués de Plasmodium à l’aide d’un système à haut débit pour soutenir de nouvelles stratégies visant à interrompre la transmission du paludisme. Ce protocole comble le manque de méthodes standardisées à haut débit pour identifier les composés bloquant la transmission en utilisant une lignée transgénique de P. berghei avec détection automatisée de la phase de luminescence du développement parasitaire post-fécondation. Ce protocole permet le criblage des stades sexuels de Plasmodium, détecte les composés bloquant la transmission précoce et prend en charge une détermination précise de l’IC50, offrant des avantages par rapport aux méthodes conventionnelles.

Pour commencer, préparez les échantillons de composés en diluant le stock de composé à un millimolaire à l’aide d’un milieu d’ookinète. Préparez les échantillons de travail en diluant ce stock d’un millimolaire dans un milieu ookinète dans un rapport de un à 100 pour obtenir une concentration finale de 10 micromolaires. Pour un essai, préparer un volume final de 200 microlitres d’échantillon de travail en double.

Si le composé est dissous dans un solvant autre que l’eau, préparer un échantillon témoin en diluant le solvant dans le milieu ookinète dans la même proportion que celle utilisée pour l’échantillon d’essai. À l’aide de deux plaques de 96 puits, placez 80 microlitres de chaque échantillon dans les puits désignés pour le contrôle positif, le contrôle négatif, le contrôle des solvants et testez les échantillons en double selon la disposition donnée. Ajoutez quatre microlitres de sang de souris parasité dans chaque puits dans un rapport de un à 20, à l’exception des puits de contrôle négatifs.

Homogénéiser doucement en pipetant de haut en bas. Pour le contrôle négatif, ajoutez du sang de souris non infecté dans chaque puits dans un rapport de un à 20 et homogénéisez doucement par pipetage. Placez les plaques dans un incubateur réglé à 21 degrés Celsius et incubez pendant six heures ou 24 heures.

Après l’incubation, homogénéisez chaque échantillon en le pipetant de haut en bas pour assurer un bon mélange du milieu sanguin. Préparez le mélange de tampon de lyse et de substrat de luciférase dans un rapport de un à 50 immédiatement avant utilisation. Mélangez ce mélange de substrat de tampon de lyse avec chaque échantillon dans un rapport de un pour un, en assurant un mélange doux sans introduire de bulles.

Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Maintenant, transférez les échantillons sur une plaque blanche à fond plat de 96 puits et mesurez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques. Après le test de luminescence, enregistrez les données de luminescence brutes affichées par le lecteur de plaques.

À l’aide d’une feuille de calcul, calculez la moyenne de chaque mesure à l’aide de la formule donnée. Remplacez XX par l’adresse de la première cellule de mesure et YY par l’adresse de la deuxième cellule de mesure. Répétez la formule pour tous les échantillons.

Convertissez les données en pourcentage d’inhibition à l’aide de la formule donnée, où A est la valeur de l’unité de lumière relative de l’échantillon et B est la valeur de l’unité de lumière relative de contrôle. Sélectionnez des composés qui présentent une inhibition supérieure à 95 % pour la concentration inhibitrice déterminée à 50 %. Après avoir infecté des souris avec Ookluc et prélevé du sang parasité, préparez des échantillons de composés en utilisant un milieu d’ookinete comme diluant à la concentration initiale qui a montré une inhibition de 100 % de la conversion.

Pipeter les échantillons en trois exemplaires dans une plaque de 96 puits en suivant la disposition spécifiée. À l’aide d’une pipette, effectuez des dilutions en série en transférant 80 microlitres du puits D1 dans le puits D2, en mélangeant soigneusement, puis en transférant 80 microlitres de D2 à D3 et en continuant ce processus jusqu’à J12. Jetez les 80 derniers microlitres retirés du D12 pour maintenir 80 microlitres par puits.

Maintenant, ajoutez du sang de souris parasité dans chaque puits dans un rapport de un à 20 et homogénéisez doucement par pipetage. Dans les puits de contrôle négatif, ajoutez du sang de souris non infecté dans un rapport de un à 20 et homogénéisez doucement. Placez la plaque dans un incubateur réglé à 21 degrés Celsius et incubez pendant six ou 24 heures avant d’effectuer le test de luminescence.

Après avoir calculé le pourcentage d’inhibition, ouvrez le logiciel d’analyse et créez une table XY pour le traçage. Définissez l’axe des y pour entrer trois valeurs de réplication dans des sous-colonnes côte à côte. Collez les données dans le tableau avec x représentant la concentration du composé et y représentant le pourcentage d’inhibition.

Maintenant, cliquez sur Analyser. Sélectionnez Régression non linéaire, Ajustement de la courbe, puis Courbes dose-réponse, Inhibition, puis Inhibiteur par rapport à la réponse normalisée, Pente variable, puis cliquez sur OK. Affichez la courbe dose-réponse sur le panneau de gauche et appliquez des personnalisations, telles que des changements de couleur ou de format de point.

Localisez la table d’ajustement non linéaire pour trouver la CI50 calculée et l’intervalle de confiance à 95 %. La pyrimidine azépine 90 a démontré une inhibition claire de l’activité cible en fonction de la concentration, avec une inhibition supérieure à 95 % observée à des concentrations de 0,125 à une micromolaire, et une perte complète d’activité inférieure à 0,007 micromolaire, suggérant un effet de seuil marqué dans sa réponse inhibitrice. La courbe dose-réponse ajustée aux données de la pyrimidine azépine 90 a donné une valeur CI50 de 0,013 micromolaire, indiquant une puissance élevée dans l’inhibition de l’activité ciblée.