Dissection rapide et dissociation de l’épithélium olfactif de souris pour des suspensions à noyau unique
1 août 2025
Cet article fournit un protocole simplifié pour la dissection et la dissociation de l’épithélium olfactif murin à des fins de séquençage de l’ARN à noyau unique.
Nous fournissons ici un protocole conçu pour aider à la dissection rapide de l’épithélium olfactif à des fins de séquençage de cellule unique ou de noyau unique. Notre protocole privilégie la vitesse et la facilité d’apprentissage, et il est idéal pour les applications unicellulaires où le tissu est homogénéisé et où la dissection rapide est plus importante que la préservation de l’intégrité anatomique, contrairement aux méthodes précédentes. Notre protocole permet une dissection rapide et conviviale de l’épithélium olfactif, dans le but de faciliter les études de séquençage de cellules uniques et de promouvoir la recherche sur les bases génétiques du système olfactif.
Pour commencer, obtenez la tête dépecée d’une souris. À l’aide d’une paire de ciseaux fins à pointe pointue, faites deux incisions pour briser les arcades zygomatiques de l’os squamosal de manière bilatérale en plaçant une pointe de ciseau dans l’orbite postérieure et l’autre adjacente au conduit auditif. Faites une incision peu profonde d’une orbite à l’autre le long de la face la plus antérieure de l’os frontal, en incisant uniquement la surface dorsale de l’os frontal à une profondeur d’environ un à deux millimètres.
Maintenant, coupez le long de la ligne médiane du crâne à partir du foramen magnum à travers les sutures sagittales et interfrontales jusqu’à atteindre l’incision interorbitaire faite précédemment. Insérez une paire de pinces dans l’incision médiane et tirez fermement un hémisphère de la voûte crânienne latéralement. Tout en tenant l’os nasal et les incisives, utilisez des pinces pour briser la voûte crânienne controlatérale.
Laissez le cerveau, y compris les bulbes olfactifs, être enlevé avec l’hémisphère de l’os au fur et à mesure qu’il est arraché. Ensuite, utilisez des pinces osseuses ou des Rongeurs pour retirer tout os frontal et prémaxillaire restant jusqu’à la base des incisives. Coupez le long de la suture fronto-nasale avec des pinces osseuses pour libérer l’os nasal de la plaque cribriforme.
Ensuite, utilisez des pinces pour soulever l’os nasal de la plaque cribriforme afin d’exposer l’épithélium olfactif. Si l’os prémaxillaire résiduel obstrue l’épithélium olfactif dorsal, retirez-le avant de continuer. Maintenant, utilisez une paire de pinces à pointe fine pour fixer doucement la face dorsale de la cloison nasale à sa jonction avec la plaque cribriforme, et tirez-la vers l’arrière.
L’épithélium olfactif principal se libérera sous la forme d’une structure entièrement intacte. La cytométrie en flux d’imagerie a identifié que 53,69 % de tous les événements étaient des noyaux. Parmi les noyaux uniques, 53,89 % présentaient une circularité élevée.
Les parcelles de contrôle de la qualité ont confirmé une qualité de séquençage constante sur quatre échantillons, avec des distributions uniformes des gènes et du nombre mitochondrial. Les gènes marqueurs de l’ensemble de données sont cohérents avec de nombreux gènes marqueurs bien établis pour chaque type de cellule.
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Aperçu
Cet article décrit un protocole de dissection et de dissociation rapides de l'épithélium olfactif murin, conçu pour faciliter le séquençage de l'ARN au niveau du noyau unique. La méthode privilégie la rapidité et la facilité d'exécution, ce qui la rend adaptée aux applications nécessitant l'homogénéisation du tissu.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Génomique
- Recherche sur le système olfactif
Contexte
- Le séquençage ARN à cellule unique et à noyau unique est essentiel pour comprendre la diversité cellulaire.
- Les méthodes de dissection antérieures mettaient l'accent sur l'intégrité anatomique, ce qui peut ne pas être idéal pour certaines applications.
- L'épithélium olfactif joue un rôle fondamental dans la transduction sensorielle olfactive.
- L'amélioration des techniques de dissection peut accroître l'efficacité des études génétiques liées à l'olfaction.
Objectif de l'étude
- Proposer un protocole convivial pour la dissection de l'épithélium olfactif.
- Faciliter le traitement rapide des tissus destinés à des études de séquençage à la cellule unique.
- Encourager la recherche sur les mécanismes génétiques du système olfactif.
Méthodes utilisées
- La méthode utilise la dissection de l'épithélium olfactif à partir de modèles murins.
- Ce modèle biologique implique le système olfactif de la souris, soulignant la nécessité d'une extraction rapide.
- La suppression des os et une manipulation soigneuse préservent l'intégrité de l'épithélium olfactif principal.
- Les étapes clés comprennent des incisions dans la voûte crânienne et l'extraction des structures olfactives.
- Des contrôles de qualité ont été mis en place pour maintenir une qualité de séquençage constante.
Résultats principaux
- Plus de la moitié des événements collectés ont été identifiés comme des noyaux, indiquant une isolation réussie.
- La forte circularité des noyaux suggère une préservation de qualité durant la dissection.
- Le contrôle de qualité a révélé des distributions uniformes des gènes et des mitochondries.
- Les gènes marqueurs étaient alignés sur les références établies pour les types cellulaires.
Conclusions
- L'étude présente un progrès méthodologique rapide pour la dissection de l'épithélium olfactif.
- En permettant un séquençage efficace au niveau du noyau unique, elle contribue à la compréhension des facteurs génétiques impliqués dans l'olfaction.
- Ce protocole pourrait améliorer l'analyse des mécanismes neuronaux et de la plasticité dans les systèmes sensoriels.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La préparation rapide et reproductible de suspensions de noyaux isolés à partir de l'épithélium olfactif de la souris permet le profilage moléculaire à haute résolution de diverses populations neuronales et progénitrices. Ce protocole surmonte un goulot d'étranglement majeur en génomique unicellulaire en réduisant au minimum la durée d'extraction du tissu et en préservant l'intégrité nucléaire, ce qui renforce la validation robuste des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans les flux de travail en neurosciences sensorielles. Cette approche améliore la fiabilité prédictive dans les recherches exploratoires précoces et la recherche translationnelle axée sur la base génétique de la fonction olfactive et de la régénération.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet un test rapide d'hypothèses sur l'expression génique dans les neurones sensoriels olfactifs et leurs cellules progénitrices.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en préservant la qualité nucléaire pour le séquençage en aval.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques liés aux voies candidates impliquées dans le renouvellement des neurones sensoriels.
- Améliore la fiabilité prédictive pour le classement par ordre de priorité des cibles en recherche sur les systèmes sensoriels.
Développement de criblages et de tests
- Permet d'obtenir des suspensions de noyaux individuels de haute qualité, adaptées aux protocoles standardisés de séquençage à la cellule unique.
- Garantit la reproductibilité et l'extensibilité entre plusieurs échantillons et séries expérimentales.
- Fournit des résultats quantitatifs, incluant le rendement nucléaire et les indicateurs de qualité, pour l'évaluation comparative des tests.
- Permet une évaluation fiable des modifications de l'expression génique en réponse à des perturbations expérimentales.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour l'étude des troubles et de la régénération olfactifs.
- Permet une continuité allant de la génomique en phase de découverte à la validation préclinique de cibles moléculaires.
- Réduit les risques biologiques en fournissant des données cohérentes et de haute qualité pour l'identification de biomarqueurs translationnels.
- Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque dans les portefeuilles de neurosciences sensorielles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et l'identification de composés candidats, permettant une transition fluide entre l'extraction des tissus et le séquençage au niveau du noyau unique, ainsi que les analyses en aval.
- Biologie de la découverte : Accélère le test des hypothèses et la clarification des voies dans la recherche sur le système olfactif.
- Tri : Fournit des suspensions nucléaires prêtes à l'essai avec des métriques de qualité validées.
- Analytique : Fournit des lectures quantitatives permettant de comparer l'expression génique entre les types cellulaires et les conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs et le développement de modèles précliniques pour les troubles olfactifs.
- Réutilisation en entreprise : Établit un protocole standardisé et réutilisable pour la préparation de noyaux uniques à partir de tissus sensoriels.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et le débit en génomique unicellulaire.
- Valeur stratégique : Permet des décisions éclairées de poursuite ou d'abandon et une gestion efficace du portefeuille en termes de capital.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et le développement de programmes en neurosciences sensorielles fondés sur une évaluation ajustée des risques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise technique en dissection rapide et en isolement de noyaux à partir de structures anatomiques complexes.
- Exige un accès à des instruments spécialisés pour le traitement des tissus et le contrôle qualité (par exemple, la cytométrie en flux avec imagerie).
- Implique une standardisation entre équipes afin d’assurer la reproductibilité entre les études et les opérateurs.
- Peut nécessiter des adaptations pour être utilisé avec d'autres types de tissus ou des systèmes modèles présentant des caractéristiques anatomiques différentes.
- Une extraction axée sur la rapidité peut limiter les applications où l'intégrité anatomique est essentielle.
