Suivi in vivo guidé par l’image de cellules progénitrices de l’épithélium pulmonaire distal transplantées pour la fibrose pulmonaire à l’aide de l’imagerie par particules magnétiques

Cette étude se concentre sur le protocole d’intubation intratrachéale comme méthode de délivrance critique pour la thérapie cellulaire pulmonaire, visant à optimiser la transplantation cellulaire et le suivi non invasif grâce à l’imagerie par particules magnétiques dans la fibrose pulmonaire. Notre protocole traite le manque de méthodes non invasives pour le suivi in vivo de la thérapie cellulaire dans la fibrose pulmonaire en combinant l’isolation intratrachéale avec l’imagerie par particules magnétiques pour surveiller la distribution cellulaire. Notre protocole offre une livraison cellulaire localisée précise via l’installation intratrachéale et un suivi supérieur grâce à l’imagerie magnétique par particules, offrant une imagerie en temps réel à haute sensibilité sans bruit de fond.

Pour commencer, peser un mâle de 12 semaines de souris avec NO ou SCID afin de calculer la dose requise de bléomycine. Préparez la solution de bléomycine dans un sérum stérile à la concentration souhaitée jusqu’à un volume final de 50 microlitres dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre. Ensuite, chargez la solution dans une pipette.

Préchargez une seringue avec 200 microlitres d’air pour s’assurer que tout le volume liquide est expulsé dans la trachée lors de l’injection. Après avoir anesthésé la souris, assemblez le kit d’intubation à fibre légère avec la sonde à fibre optique passée dans le laryngoscope et le cathéter. Pincez l’orteil de l’animal pour confirmer une anesthésie adéquate et appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux chaque fois qu’il est sous anesthésie.

Suspendez la souris par ses incisives en position couchée sur un support d’intubation incliné. À l’aide de pinces émoussées, saisissez la langue et déplacez-la doucement vers le haut et la gauche pour exposer le larynx et une visualisation claire. Allumez la sonde à fibre optique et guidez-la dans la bouche pour approcher la trachée.

Utilisez la loupe du laryngoscope pour améliorer la visibilité et identifier les cordes vocales à l’ouverture trachéale. Insérez le cathéter dans l’ouverture trachéale et retirez doucement le laryngoscope. Ensuite, placez une gouttelette de 20 microlitres de solution saline à l’extrémité supérieure du cathéter.

Fixez la seringue préchargée avec 200 microlitres d’air et poussez la gouttelette dans la trachée. Ensuite, chargez le cathéter avec jusqu’à 50 microlitres de bléomycine et injectez-le à l’aide d’une seringue remplie d’air. Gardez le cathéter en place pendant 5 à 7 secondes pour éviter le reflux de liquide de la trachée.

Ensuite, retirez doucement le cathéter. Maintenez la souris sur le support d’intubation dans la même position pendant au moins 30 secondes. Ensuite, retirez la souris du support et placez-la dans une cage de récupération placée sur un coussin chauffant.

Surveillez la souris en continu jusqu’à ce qu’elle se remette complètement de l’anesthésie. Obtenir des cellules épithéliales humaines marquées par nanoparticules chez des patients atteints de mucoviscidosse pulmonaire idiopathique. 72 heures après l’installation de la bléomycine, réanesthésiez la souris et répétez la procédure d’installation intratrachéale pour administrer 50 000 cellules dans 50 microlitres de suspension cellulaire.

Laissez la souris récupérer pendant au moins 20 minutes avant l’imagerie par particules magnétiques. Installez le lit de souris dans le scanner d’imagerie à particules magnétiques après avoir passé la ligne d’anesthésie sous le lit à travers les bons connecteurs. Pendant que la souris est anesthésique, préparez le scanner d’imagerie par particules magnétiques.

Après confirmation d’une anesthésie adéquate par un test pincé de l’orteil, positionnez soigneusement la souris sur le lit d’imagerie magnétique des particules. Poussez le lit avec la souris dans le canon du scanner et cliquez sur Start Scan dans l’interface logicielle pour lancer l’imagerie. Après la fin du scan, retirez la souris du lit d’imagerie magnétique et placez-la dans une cage de récupération placée sur un coussin chauffant.

Enfin, analysez les images acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. L’intensité du signal d’imagerie par particules magnétiques 2D ou MPI augmentait proportionnellement à la concentration du traceur d’oxyde de fer sur tous les décomptes cellulaires testés. Une concentration de 250 microgrammes par millilitre a été choisie comme concentration optimale de marquage.

La microscopie à fluorescence a confirmé le marquage in vitro réussi des cellules, montrant des signaux de dextran rouge dans le cytoplasme et des noyaux colorés en DAPI bleu. Les intensités du signal dans les images MPI 2D augmentent avec le nombre de cellules marquées, confirmant une corrélation positive entre le nombre de signaux et le nombre de cellules. Sur cette base, 50 000 cellules ont été sélectionnées pour la transplantation.

L’image de contrôle du plateau vide ne montrait aucun signal MPI en arrière-plan, confirmant la spécificité du scanner pour les cellules marquées. Les quatre signaux observés correspondent à des marqueurs fiduciaux utilisés comme témoins. La transplantation réussie de cellules marquées dans les poumons a produit un signal MPI distinct en forme de papillon, avec une distribution visible dans les deux poumons, validant une livraison intratrachéale efficace.

Une installation cellulaire incomplète a entraîné l’apparition de signaux à la fois dans les poumons et la région du cou, indiquant une fuite due au retrait prématuré du cathéter. Un mauvais placement du cathéter dans l’œsophage au lieu de la trachée faisait apparaître le signal MPI plus bas dans l’abdomen, indiquant le dépôt de cellules dans l’estomac. Quatorze jours après la transplantation, des images ex vivo des poumons excisés ont confirmé la persistance des cellules marquées.

Nos résultats amélioreront la précision diagnostique et permettront le développement de thérapies ciblées pour les maladies pulmonaires, notamment la thérapie par cellules souches, accélérant ainsi les progrès et l’innovation en imagerie pulmonaire et dans les domaines biomédicaux connexes. Notre laboratoire se concentrera sur l’amélioration des thérapies à base de cellules souches pour la fibrose pulmonaire, en améliorant les techniques d’imagerie non invasive, tout en visant à optimiser la délivrance cellulaire et à surveiller l’efficacité thérapeutique de la fibrose pulmonaire.