Un protocole basé sur la fluorescence pour le dépistage préliminaire des inhibiteurs de synthèse protéique provenant de sources naturelles

Un protocole basé sur la fluorescence pour le dépistage préliminaire des inhibiteurs de synthèse protéique provenant de sources naturelles. La synthèse protéique implique des processus fortement régulés, la transcription et la traduction. La transcription est principalement régulée par des facteurs de transcription, des modifications de la chromatine et des ARN régulateurs.

La translation est régulée par des facteurs d’initiation, des voies de signalisation et des mécanismes de stabilité de l’ARN. Ces systèmes régulateurs permettent aux cellules de maintenir les fonctions cellulaires et de répondre efficacement au stress ou aux dommages. Les cellules cancéreuses dérégulent la synthèse protéique en détournant les mécanismes de translation pour soutenir leurs besoins énergétiques élevés et leur croissance incontrôlée.

Cette reprogrammation résulte d’une dysrégulation de presque toutes les principales voies de signalisation oncogéniques, favorisant la survie cellulaire, la prolifération et la métastase tout en supprimant les voies de mort cellulaire. Puisque cette synthèse protéique améliorée est cruciale pour la survie au cancer, les traitements ciblant et bloquant ce processus montrent des potentiels potentiels. Pour identifier les inhibiteurs de synthèse des protéines, le test de fluorescence d’inhibition de la synthèse protéique suivant peut être utilisé.

Avant de commencer l’expérience, pour obtenir des résultats fiables, les composés doivent être administrés à une concentration appropriée en dessous de son seuil de toxicité. Pour établir une concentration de départ, un test de cytotoxicité doit être réalisé afin de déterminer la CE 50 du composé. Si cela n’est pas faisable, les composés de ce test peuvent être testés de manière dépendante de la dose afin de déterminer les paramètres de concentration les plus efficaces.

Si la concentration des composés déclenche la mort cellulaire, des tests à des concentrations réduites deviennent nécessaires. Il est également important de protéger les teintures de la lumière en permanence lorsqu’elles ne sont pas utilisées. Une exposition prolongée à la lumière entraînera un photoblanchiment, ce qui compromet la qualité des données.

Étape 3.1 : préparer le mélange maître A, étiqueter un tube centrifugeuse comme A, puis pipeter 598,5 microlitres de milieu de culture et 1,5 microlitres de marquage protéique dans A. Resuspendre ce mélange pour assurer l’homogénéité en pipettant vers le haut et le bas. Préparez maintenant le mélange maître B. Veuillez étiqueter un tube centrifugeuse comme B, puis pipeter 1,5 microlitres de marquage protéique, 6,6 microlitres de cycloheximide et 591,9 microlitres de milieu de culture dans le B. Resuspendez ce mélange pour assurer l’homogénéité en pipettant vers le haut et vers le bas. Après avoir pipeté un microlitre de composé test et un microlitre de véhicule dans deux puits, pipettez doucement 99 microlitres de mélange maître A dans ces deux puits, et pipettez en angle sur le côté du puits pour éviter la perturbation cinétique des cellules.

Pipettez 100 microlitres de mélange master B dans deux puits non traités. Pipette en angle vers le côté du puits pour éviter la perturbation cinétique des cellules. Tapotez doucement la plaque pour intégrer en profondeur les composants désirés dans les cellules.

Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à deux heures. Retirez le milieu de culture cellulaire par aspiration. Inclinez la plaque et aspirez sur le côté du puits plutôt que par le centre pour éviter les perturbations cinétiques des cellules.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon PBS dans chaque puits et centrifugez la plaque à 900g pendant cinq minutes. Après centrifugation, souvenez-vous de retirer le tampon PBS par aspiration. Cinquième étape, fixation et perméabilisation.

Ajoutez 100 microlitres de solution fixative à chaque puits. Ensuite, incubez les cellules à température ambiante pendant 15 minutes dans un environnement sombre. Ensuite, aspirez les cellules.

Lavez les cellules avec 100 microlitres de tampon de lavage et retirez par aspiration. Répétez cela deux fois. Ajoutez 100 microlitres de tampon de perméabilisation à chaque puits.

Ensuite, incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Retirez le tampon de perméabilisation par aspiration. Étape six, réaction protéique et coloration.

Préparez le cocktail master mix de réaction. Ajoutez 651 microlitres de tampon PBS à un tube centrifugeuse. Puis ajoutez sept microlitres de réactif cuivre 100x.

Puis sept microlitres d’azide fluorescente. Et enfin, ajoutez 35 microlitres d’agent réducteur au tube de centrifugeuse. Suivez exactement cet ordre lors de l’ajout des réactifs, puis ajoutez 100 microlitres du cocktail de réaction dans chaque puits.

Incubez les cellules pendant 30 minutes dans un environnement sombre à température ambiante pour éviter le photoblanchiment. Centrifugez les cellules à 900g pendant cinq minutes. Aspirez, lavez les cellules puis aspirez à nouveau.

Préparez une dilution 1x de coloration ADN totale et ajoutez 100 microlitres à chaque puits. Incubez les cellules à température ambiante pendant 20 minutes dans un environnement sombre pour éviter le photoblanchiment. Centrifugez la plaque à 900g pendant cinq minutes.

Lavez les cellules avec 100 microlitres de tampon de lavage, retirez par aspiration. Répétez cette étape deux fois. Enfin, resuspendez les cellules avec 100 microlitres de tampon PBS refroidi pour les préparer à l’imagerie.

Étape huit, imagerie. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques et réglez le grossissement à 20 x. Analysez la coloration du noyau avec le canal GFP 469/525 nanométriques.

Utilisez l’auto-flexion et l’auto-focus pour améliorer les résultats d’imagerie. Analyser la synthèse protéique active avec le canal Texas Red 586/647 nanomètres. Utilisez l’auto-flexion et l’auto-focus pour améliorer les résultats d’imagerie.

Les sondes fluorescentes sont sensibles au photoblanchiment, un phénomène dans lequel un rayonnement lumineux fait perdre aux fluorophores leurs propriétés fluorescentes. Les colorants doivent être protégés de la lumière en permanence lorsqu’ils ne sont pas utilisés. De plus, le nombre de scans dans chaque puits et le temps passé sous lumière irradiée doivent être limités.

Une exposition prolongée à la lumière entraînera un photoblanchiment, ce qui finit par compromettre la qualité des données. Regardons les résultats représentatifs. Les cellules vivantes ici sont observées en vert et la synthèse active des protéines est indiquée par le rouge.

L’inhibiteur de synthèse des protéines connu cycloheximide entraîne une forte diminution de la synthèse protéique, comme le montre la figure 1B comparé au DMSO témoin négatif de la figure 1A, où la lumière fluorescente rouge est moins diffusée. Le traitement par composé un, comme montré à la figure 1C, a entraîné soit un décollement cellulaire, soit une mort cellulaire. Ainsi, nous ne pouvons pas faire d’affirmations définitives sur son activité d’inhibition de la synthèse des protéines.

Cela justifie d’autres études de réponse à la dose afin de déterminer si elle inhibe la synthèse des protéines à des concentrations plus faibles. Le composé deux présente une inhibition modérée de la synthèse des protéines, comme indiqué à la figure 1D. Ce test fluorométrique est un outil de recherche précieux et une méthode de biologie chimique accessible pour former les étudiants de premier cycle.

En fournissant un protocole accessible et efficace avec un traitement minimal des données, il offre aux étudiants une expérience pratique et des techniques modernes de découverte de médicaments, et accélère le processus de découverte de médicaments. Le protocole utilise un substrat fluorescent et des techniques avancées de microscopie fluorescente pour détecter et mesurer systématiquement les capacités inhibitrices des composés de produits naturels un et deux. En utilisant la cycloheximide comme inhibiteur de référence, les deux produits naturels ont montré des niveaux variables d’inhibition de la synthèse protéique.

À mesure que la demande pour de nouveaux inhibiteurs de synthèse protéique augmente, cette approche offre aux étudiants de premier cycle des opportunités de recherche significatives tout en contribuant aux avancées en thérapie contre le cancer.