Quantification de la violacéine dans Chromobacterium violaceum et son inhibition par des composés bioactifs

Notre recherche vise à identifier les composés qui inhibent la détection du quorum, qui régule les phénotypes clés. Ce protocole filtre les molécules qui réduisent la production de violacéine sans affecter la croissance bactérienne, suggérant une interférence de détection du quorum. Des études récentes ont identifié de nouveaux composés bioactifs qui inhibent la détection du quorum sans affecter la croissance bactérienne, renforçant ainsi leur potentiel en tant qu’agents antivirulents contre les bactéries résistantes aux antibiotiques.

Les principaux défis incluent la spécificité de l’inhibition de la détection du quorum, car les composés peuvent affecter la croissance ou les caractères. Dans ce protocole, appelé déférence et solubilité, la quantification de l’impact de l’équilibrage nécessite une manipulation soigneuse. Nous avons établi un protocole utilisé dans les composés bioactifs à des concentrations sous-inhibitrices qui n’affectent pas la croissance bactérienne.

Il s’agit d’une prémisse clé pour commencer la signalisation de détection du quorum, différente de la recherche antimicrobienne. Nous nous concentrerons sur l’identification de nouveaux inhibiteurs de l’état de quorum et sur l’élucidation des mécanismes d’inhibition de la communication, en particulier chez les bactéries pertinentes pour l’alimentation et la santé. Pour commencer, cultivez une culture de cinq millilitres de chromobacterium violaceum ATCC 12472 dans un bouillon Luria Bertani ou LB.

Incuber la culture à 30 degrés Celsius dans un incubateur secouant réglé à 220 tours par minute pendant 24 heures. Mesurez la densité optique de la culture de nuit et ajustez-la à environ une fois 10 à la puissance huit unités formant colonie par millilitre. Utilisation du bouillon LB.

Pour la préparation du composé, pesez le composé bioactif et diluez-le dans du DMSO pur ou un mélange individuel de DMSO et d’eau en fonction de la solubilité. Prenez une assiette à fond plat à 96 puits et ajoutez du bouillon LB avec le composé bioactif selon un schéma de dilution en série. Pour calculer le volume requis de solution mère pour la concentration souhaitée dans chaque puits, appliquez la formule.

Dans la première colonne de chaque kit de dilution de céréales. Ajoutez 196 microlitres de bouillon Luria Bertani aux colonnes trois, cinq et sept. Ensuite, dans les colonnes suivantes utilisées pour la dilution, ajoutez 100 microlitres de bouillon Luria Bertani aux colonnes quatre, six et huit.

Pour initier la dilution en série, ajoutez quatre microlitres du composé bioactif dans le premier puits de chaque ensemble, ce qui correspond aux colonnes trois, cinq et sept. Après le mélange, transférez 100 microlitres de chaque puits dans la colonne adjacente. Poursuivre la dilution en série jusqu’aux colonnes quatre, six et huit.

Répétez toute la procédure en trois exemplaires pour chaque concentration de chaque composé à l’aide de pointes neuves pour éviter la contamination croisée. Ajouter 80 microlitres de bouillon Luria Bertani aux rangées B à D dans tous les puits. Portant le total à 180 microlitres par puits.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de la culture standardisée de chromobacterium violaceum de la préparation précédente dans chacun de ces puits, atteignant un volume final de 200 microlitres. Basé sur la compatibilité du spectrophotomètre. Couvrez la microplaque avec un couvercle ou un film d’étanchéité pour éviter l’évaporation.

Incuber la plaque scellée à 30 degrés Celsius avec agitation à 130 tours par minute pendant 24 heures. Après l’incubation, transférez la plaque dans un incubateur de séchage réglé à 60 degrés Celsius. Retirez le couvercle et laissez-le sécher complètement pendant environ huit heures.

Une fois sèche, retirez la plaque de l’incubateur et ajoutez 200 microlitres de DMSO pur dans chaque puits. Couvrez la plaque et incubez-la à 25 degrés Celsius en agitant à 130 tours par minute pendant 30 minutes pour dissoudre le pigment violacéine. Après l’incubation, transférez soigneusement 100 microlitres de la solution de violacéine dissoute dans une nouvelle microplaque.

Éviter le contact entre la pointe de la pipette et les parois du puits. Mesurez l’absorbance de la violacéine à 595 nanomètres dans un spectrophotomètre à microplaques avec le couvercle fermé pour éviter toute contamination. Agitez pendant cinq secondes avant chaque lecture et effectuez la lecture avec le couvercle pour éviter toute contamination.

Pour calculer la production de violacéine, il faut d’abord soustraire l’absorbance du blanc de chaque échantillon afin d’exclure les interférences de fond, puis calculer le pourcentage de violacéine en utilisant le témoin non traité comme référence avec l’équation. Trois composés bioactifs, le resvératrol, le farnésol et le linalol, ont été testés pour leur capacité à inhiber la production de violacéine dans la souche ATCC 12472 de Chromobacterium violaceum. Farnesol a significativement réduit la production de violacéine à 9 % à 200 microgrammes par millilitre et à 19 % à 100 microgrammes par millilitre, contre 100 % chez le témoin non traité.

Le traitement au linalol à 200 et 100 microgrammes par millilitre a entraîné une production de violacéine de 32 %, montrant une inhibition de 68 % par rapport au contrôle. Le resvératrol à 25 microgrammes par millilitre a réduit la production de violacéine à 15 % tandis qu’à 12 microgrammes par millilitre, elle a atteint 30 % contre 100 % chez le témoin non traité. Des images sur microplaques ont confirmé visuellement une réduction de la pigmentation de la violacéine pour tous les traitements par rapport au témoin non traité.