Analyse comportementale de la dysfonction locomotrice chez Drosophila melanogaster comme lecture de la neurotoxicité

L’objectif de notre recherche est de développer une méthode hautement rentable et éthique pour le dépistage des composés neurotoxiques. Les méthodes traditionnelles d’essais toxicologiques reposent souvent sur des modèles de taux virtuels, qui sont coûteux, prennent du temps, sinon des préoccupations éthiques comme nous le savons. Nous voulions explorer si nous pouvions détecter des signes précoces de neurotoxicité à l’aide d’un modèle alternatif comme une Drosophila melanogaster qui est à la fois sensible et évolutive. Ce protocole nous aide à détecter des phénotypes comportementaux tels que les altérations des schémas de mouvement et l’hyperactivité, mais aussi le déclin moteur progressif ou les perturbations écrites de la sécurité, et la large préférence est également testée.

Ce qui rend notre protocole avantageux, c’est qu’il combine le test d’escalade classique avec une technologie de surveillance en temps réel, ce qui nous permet de capturer des déficiences motrices subtiles qui pourraient être manquées. Par des méthodes traditionnelles, fournissant une sensibilité plus élevée et des données comportementales plus précises.

[Narrateur] Pour commencer, transférez doucement les mouches dans une bouteille vide. Placez la bouteille contenant les mouches à l’intérieur d’une boîte remplie de glace, en vous assurant que toute la bouteille est couverte. Au bout d’une minute, tapotez doucement le flacon pour vérifier que toutes les mouches sont anesthésiées. Préparez un récipient plus petit rempli de glace. Placez une boîte de Pétri ou une surface plane et propre sur la glace pour créer une plate-forme réfrigérée. Maintenant, retournez le tube sur la boîte de Pétri réfrigérée et tapotez doucement pour libérer les mouches sur la surface froide. Transférez soigneusement les mouches dans des flacons vides. Laissez les mouches se remettre de l’anesthésie pendant 30 minutes dans un environnement contrôlé à 25 degrés Celsius avec un cycle d’obscurité légère de 12 heures et 50 % d’humidité. Ensuite, pour la préparation de l’alimentation microcapillaire, utilisez une pipette pour charger manuellement 10 microlitres de la solution de test dans chaque tube microcapillaire, en assurant un volume constant sur tous les échantillons. Ajoutez trois à cinq microlitres d’huile minérale à l’extrémité ouverte de chaque tube microcapillaire pour éviter l’évaporation et les fuites pendant l’expérience. Insérez les microcapillaires préremplis à travers les trous des bouchons des flacons de coton, en assurant un ajustement sûr. Placez les flacons contenant des mouches dans un incubateur réglé à 25 degrés Celsius avec un cycle d’obscurité de 12 heures, et laissez les flacons dans l’incubateur pendant toute la durée de l’expérience. Toutes les 12 heures, transférez les mouches dans un flacon propre et vide pour évaluer leur activité locomotrice. Mesurez et marquez une ligne à sept centimètres du bas du flacon à l’aide d’un marqueur permanent. Cette marque servira de cible d’escalade. Placez un appareil photo ou un téléphone dans un endroit stable pour enregistrer le comportement d’escalade. Assurez-vous d’un éclairage adéquat et d’un arrière-plan transparent pour permettre une visibilité et une analyse claires. Vérifiez que la configuration expérimentale est compatible avec le champ de vision de la caméra et lancez l’enregistrement. Passez en revue les enregistrements vidéo et mesurez le temps nécessaire à chaque mouche pour atteindre la marque des sept centimètres. Préparez les microcapillaires d’alimentation avec l’échantillon et le sceau d’huile minérale comme indiqué précédemment. Préparez ensuite des chambres de locomotion individuelles à l’aide de pailles en plastique transparent coupées à environ six centimètres de longueur. Scellez une extrémité de chaque paille avec un film transparent pour créer une fermeture hermétique. Près de l’extrémité scellée de la paille, créez un petit trou pour insérer le microcapillaire d’alimentation, en vous assurant qu’il est bien ajusté et qu’il ne fuit pas ou ne bouge pas pendant le test. Après avoir anesthésié et séparé les mouches comme indiqué précédemment, placez doucement une mouche anesthésiée dans chaque tube à l’aide d’un pinceau fin. Scellez l’extrémité ouverte de chaque tube avec un film transparent ou un bouchon en coton, permettant à l’air de circuler tout en empêchant la fuite. Insérez maintenant un microcapillaire prérempli dans chaque chambre préparée par le trou désigné. Placez les tubes assemblés dans l’arène de test, en vous assurant que les microcapillaires restent accessibles pour le remplacement quotidien. Placez l’ensemble de l’installation à l’intérieur d’une chambre maintenue à 25 degrés Celsius avec un cycle d’obscurité légère de 12 heures et un taux d’humidité de 50 %. Connectez l’appareil au système de suivi local ou au réseau. Accédez à la plateforme logicielle et localisez l’appareil attribué à l’expérience. Assurez-vous que le système suit correctement chaque mouche en fonction de marqueurs visuels. Entrez toutes les métadonnées expérimentales et commencez à enregistrer le test. La capacité de montée évaluée à l’aide du test de géotaxie négative à 24 et 48 heures montre des performances similaires entre les groupes témoin et de traitement à 24 heures, indiquant qu’il n’y a pas de déficits moteurs immédiats. Au bout de 48 heures, les mouches traitées mettent près de deux fois plus de temps à grimper que les témoins, ce qui reflète une déficience motrice importante. Le suivi continu de l’activité révèle que les mouches traitées présentent initialement un mouvement accru, mais que leur activité diminue fortement après 12 heures, ce qui suggère une hyperexcitabilité précoce suivie d’une fonction motrice réduite. Au bout de 24 à 40 heures, les mouches traitées présentent un mouvement réduit par rapport aux témoins. Dans l’ensemble, les mouches traitées ont une activité réduite d’environ 20 % en 40 heures. Les mouches traitées ont d’abord réagi par un retard aux signaux lumineux suivi d’un alignement circadien transitoire, mais ont progressivement perdu leur rythmicité au bout de 48 heures, probablement en raison d’un déficit locomoteur. Les mouches traitées préfèrent les zones lumineuses plus que les témoins.