In vitro Reconstitution de réseaux cytosquelettiques à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes (GUV) en phase séparée

Notre recherche vise à déterminer si une cellule synthétique minimale peut reproduire des fonctions biologiques clés, en se concentrant sur la conception de membranes qui imitent étroitement la structure et le comportement des membranes cellulaires naturelles.

Différentes technologies sont utilisées pour fabriquer des vésicules à séparation de phase et utiliser ces microsupports pour une variété d’applications. Les technologies, par exemple, sont le cDICE double couche et l’électroformation. L’un des principaux défis consiste à maintenir la fonctionnalité des protéines tout en générant une séparation de phase sur la vésicule membranaire. L’augmentation de la température peut déstabiliser les protéines et autres biomolécules.

[Narrateur] Pour commencer, procurez-vous des flacons de mélanges lipidiques biotinylés et non biotinylés. Dissoudre 50 microlitres de chaque mélange de lipides de 32 millimolaires dans du chloroforme. Ensuite, séchez-les dans deux flacons en verre sous flux d’azote gazeux pendant environ 15 minutes. Placez les flacons en verre dans un dessiccateur. Conservez-les sous vide pendant environ 30 minutes pour éliminer tout résidu de chloroforme. Maintenant, dispersez les films lipidiques séchés dans un mélange de 20 microlitres de décane et de 500 microlitres d’huile minérale dans les mêmes flacons pour obtenir une concentration lipidique finale de 3,2 millimolaires. À l’aide d’un sonicateur de bain, soniser les deux mélanges à environ 50 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, transférez les mélanges de lipides et d’huiles dans deux tubes. Pendant que les mélanges sont en incubation, préparez le mélange d’encapsulation interne pour les protéines. Pour préparer le mélange de protéines FtsZ, ajoutez les réactifs énumérés à un volume final de 10 microlitres dans un tube. Gardez le mélange sur de la glace jusqu’à utilisation. Pour l’encapsulation des faisceaux d’actine, préparez d’abord 10 microlitres de l’actine Master Mix, contenant 86 % de G-actine, 10 % d’actine ATTO 488 et 4 % d’actine biotinylée dans l’eau. Gardez le mélange sur de la glace et protégez-le de la lumière. Juste avant l’utilisation, préparez la solution finale d’actine en ajoutant, dans l’ordre, de l’iodixanol, de l’eau, du NeutrAvidin, du BSA, du Ficoll 70, un tampon de polymérisation d’actine 10x, de l’A-Mix, du fascine et de l’ATP. Mélangez bien et utilisez cinq microlitres pour l’encapsulation. Pour encapsuler FtsZ, pipetez 500 microlitres de tampon de réaction FtsZ dans un tube en plastique de 1,5 millilitre. Ajoutez doucement 200 microlitres de mélange de lipides et d’huile pour former une interface huile-eau. Dans un deuxième tube, ajoutez 200 microlitres de mélange de lipides et d’huile. Incuber ce tube à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, pipetez cinq microlitres du mélange de protéines FtsZ dans le tube incubé de lipides et d’huile, en le laissant couler sous forme de gouttelettes. Tapotez doucement le tube cinq à six fois, jusqu’à ce que la solution devienne trouble, pour former une émulsion. Pipetez soigneusement cette émulsion sur l’interface huile-eau préparée précédemment. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 6 000 g pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Refroidissez l’échantillon à température ambiante pendant 30 minutes. Maintenant, utilisez une pipette pour retirer délicatement la couche supérieure d’huile, en laissant 100 à 200 microlitres de solution pour l’imagerie. Coupez une pointe de pipette en biais. Utilisez-le pour récupérer 50 à 100 microlitres de solution GUV au fond du tube. Pour encapsuler l’actine directement dans une plaque de 96 puits, combinez 198 microlitres de glucose à deux molaires avec 802 microlitres d’eau pour préparer une solution de glucose externe correspondant à l’osmolarité du mélange d’actine interne. Passivez un puits d’une plaque de 96 puits en ajoutant 100 microlitres de BSA de 10 grammes par litre dans un puits. Après une incubation de 10 à 15 minutes, laver le puits cinq fois avec 100 microlitres de solution extérieure. Laissez 100 microlitres du lavage final. Maintenant, ajoutez doucement 50 microlitres de mélange de lipides et d’huile dans le puits en posant la pipette sur la paroi latérale pour assurer une stratification correcte sur la solution extérieure. Dans un tube séparé, ajoutez 100 microlitres de lipides dans de l’huile et incuber. Ajoutez 2,5 microlitres de solution finale d’actine dans le tube incubé de lipides et d’huile, en lui permettant de couler sous forme de gouttelettes. Tapotez doucement le fond du tube 10 à 20 fois, jusqu’à ce que le mélange devienne trouble. Pipetez doucement l’émulsion au centre de la monocouche d’huile dans le puits, sans casser l’interface. Ensuite, centrifugez la plaque à 96 puits à 200 g pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Laissez la plaque refroidir à température ambiante pendant 30 minutes avant d’imager. Des vésicules unilamellaires géantes, ou GUV, avec des membranes démélangées en domaines désordonnés et ordonnés en liquide, et un rendement élevé de vésicules de taille comprise entre cinq et 30 micromètres, ont été obtenus. Les réseaux FtsZ ont été récapitulés au sein des GUVs et préférentiellement localisés dans les domaines membranaires désordonnés par le liquide en présence de GTP et de Ficoll 70. Les réseaux d’actine, une fois reconstitués, apparaissaient sous la forme de minces faisceaux adhérant à la membrane et formant des structures clairsemées en forme de toile. Sans lipides biotinylés, les faisceaux d’actine n’ont pas adhéré à la membrane et sont restés rigides et droits dans la lumière de la vésicule. Dans des conditions de centrifugation plus élevées, les vésicules contenant de la myosine d’actine se sont agrégées en une architecture semblable à un tissu tassé dans le puits de production.