Name: Détection métabolique en temps réel dans des cellules vivantes à l’aide de la RMN 13C hyperpolarisée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Découvrez la mesure du métabolisme du pyruvate en temps réel dans des cellules vivantes par RMN ¹³C hyperpolarisée. Cette méthode améliore la reproductibilité pour les études métaboliques et le criblage de médicaments.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Acide pyruvique [1-13C]</td><td>Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.</td><td>Référence CLM-8077</td><td></td></tr><tr><td>Imprimante 3D</td><td>Elegoo</td><td>Saturne 2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Kit de circulation externe pour pompe</td><td>COMME UN</td><td>1-4141-02</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de raccords sans bride</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>6010-46390</td><td></td></tr><tr><td>Verre capillaire avec noyau</td><td>Narishige</td><td>GDC-1.5</td><td>Diamètre intérieur ~0,9 mm, longueur 90 mm</td></tr><tr><td>Pompe de circulation magnétique</td><td>COMME UN</td><td>1-4141-01</td><td></td></tr><tr><td>MestReNova</td><td>Mestrelab Recherche</td><td></td><td>Logiciel de traitement et d’analyse spectrale RMN</td></tr><tr><td>Ma seringue à injection</td><td>Nipro Corporation</td><td>8277</td><td>0,5 ml/100U, 30G x 10 mm, 140 pièces</td></tr><tr><td>OX063</td><td>&nbsp ; Oxford Instruments Co. Ltd. et Polarize IVS Co. Ltd.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tube</td><td>COMME UN</td><td>3-780-05</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>26252-94</td><td></td></tr><tr><td>Mini pompe bio-staltique</td><td>ATTO</td><td>1221200</td><td>Haute précision, type de débit large pour un débit de fluide stable</td></tr><tr><td>Résine</td><td>Siraya Tech</td><td>Noir fumé</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Moyen</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>30264-85</td><td></td></tr><tr><td>Septum fiole en silicone/PTFE</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>1030-50009</td><td></td></tr><tr><td>Alginate de sodium 80-120</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel SPINit</td><td>RS2D</td><td></td><td>Logiciel RMN dans le polariseur DNP</td></tr><tr><td>Éponge</td><td>-</td><td>-</td><td>Éponge disponible dans le commerce, coupée à la taille pour la stabilisation du gel</td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à trois voies</td><td>COMME UN</td><td>3-6247-04</td><td></td></tr><tr><td>Topspin</td><td>Bruker</td><td></td><td>Logiciel d’acquisition et de traitement de données RMN</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07086-74</td><td></td></tr><tr><td>Résine durcissable aux UV</td><td>BONDIC</td><td>BD-SKCJ</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>COMME UN</td><td>1-5832-41</td><td>Robot thermique TR Series TR-1&alpha ; pour maintenir 37 &deg ; Température C</td></tr><tr><td>Wilmad Tube RMN à bouchon à vis</td><td>Sigma</td><td>Z271977</td><td>Fréquence 400 MHz, diamètre 10 mm, L 178 mm.</td></tr></tbody></table>

détection métabolique en temps réel dans des cellules vivantes à l’aide de la rmn 13c hyperpolarisée

Real-Time Metabolic Detection in Living Cells Using Hyperpolarized 13C NMR

Dans cette étude, un système fabriqué a été couplé à une spectroscopie RMN 13C hyperpolarisée pour mesurer le métabolisme du pyruvate dans des cellules vivantes en temps réel. Les principaux signaux détectés dans le spectre RMN 1D 13C correspondaient au pyruvate (environ 171 ppm) et au lactate (environ 183 ppm)21, ce qui nous permet d’évaluer la conversion métabolique du pyruvate en lactate dans des conditions physiologiques (Figure 4).
Qualité spectrale et dynamique du signal La figure 5 présente des résultats représentatifs de mesures répétées sur le même échantillon à l’aide de cellules SCCVII – une lignée de carcinome épidermoïde de souris fréquemment utilisée dans les études d’IRM hyperpolarisée – . La première mesure a montré une nette augmentation du signal de lactate, indiquant une conversion métabolique active. Cependant, des mesures ultérieures effectuées à des intervalles de 1,5 heure ont montré un déclin progressif de l’activité métabolique. Cette réduction dépendante du temps reflète probablement le stress biologique ou l’adaptation induite par l’injection initiale de pyruvate. Notamment, une modulation métabolique transitoire similaire a été rapportée in vivo à l’aide de l’IRM hyperpolarisée et de l’EPRI, où l’oxygénation tumorale a temporairement diminué après l’administration de pyruvate22. Ces résultats démontrent que la répétabilité de ces mesures permet un suivi non destructif des changements métaboliques dynamiques – un avantage difficile à obtenir avec des méthodes destructrices23.
Pour évaluer l’applicabilité de ce protocole à d’autres types de cellules, des mesures supplémentaires ont été effectuées à l’aide de cellules HeLa, une lignée cellulaire cancéreuse humaine largement utilisée. Comme le montre la figure 6, les cellules HeLa ont également montré une conversion claire du pyruvate en lactate. Bien que l’intensité du signal ait progressivement diminué en raison de la relaxation T1, le rapport signal/bruit est resté suffisant tout au long de la période d’acquisition de 60 s. Ces résultats suggèrent que le protocole actuel est largement applicable et peut servir d’outil polyvalent pour le profilage métabolique en temps réel dans divers types de cellules.
Bien que la décroissance rapide du signal soit une limitation inhérente à la RMN basée sur DNP, notre système de mélange in situ minimise le délai entre la dissolution et la mesure, améliorant ainsi la sensibilité de détection. D’autres améliorations, telles que l’optimisation de la composition de la matrice de gel, pourraient étendre l’applicabilité de cette méthode à un plus large éventail de systèmes biologiques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig1.jpg"> 
Figure 1 : Schéma de principe du flux de travail global, de la culture cellulaire à la mesure RMN hyperpolarisée. Le processus commence par une culture cellulaire (~2 semaines), suivie d’une préparation de gel d’alginate (~60 min) pour encapsuler les cellules afin d’obtenir une mesure stable. Ensuite, l’hyperpolarisation est réalisée à l’aide d’un système de polarisation DNP (~60 min), et la mesure RMN est effectuée à l’aide d’un spectromètre RMN de 400 MHz (~5 min). Les photographies de droite montrent les instruments correspondants utilisés dans ce flux de travail. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig2.jpg"> 
Figure 2 : Configuration du bioréacteur pour la mesure RMN hyperpolarisée. (A) Schéma de principe de l’installation du bioréacteur. Le milieu de culture est introduit dans le tube RMN par l’entrée A et ensuite dirigé vers les déchets. Des billes d’alginate contenant des cellules vivantes sont placées à l’intérieur du tube RMN. Lors des mesures RMN hyperpolarisées, la sonde hyperpolarisée est injectée par l’entrée B, appelée entrée de la sonde hyperpolarisée. (B) Photographie de l’ensemble de l’installation du bioréacteur, avec les tubes d’entrée et de sortie clairement étiquetés. (C) Vue rapprochée de l’interrupteur de la tubulure d’entrée, montrant l’entrée A (perfusion moyenne) et l’entrée B (injection de sonde hyperpolarisée). (D) Conception CAO et (E) Photographie représentative du composant de fixation de l’éponge imprimé en 3D placé à l’intérieur du tube RMN. Le composant comprend un trou pour guider un capillaire en verre qui délivre la solution de substrat hyperpolarisé et une plate-forme pour tenir une éponge. Le composant lui-même ne s’adapte pas étroitement à la paroi interne du tube RMN ; (F) à la place, une éponge est insérée autour de celui-ci pour combler l’espace. Cette structure stabilise le composant et permet aux déchets de s’écouler vers le haut à travers l’éponge, éliminant ainsi le besoin d’un trou de sortie supplémentaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig3.jpg"> 
Figure 3 : Préparation du gel d’alginate. (A) Illustration schématique et (B) Photographie de l’appareil de formation de la boule de gel d’alginate. L’image de gauche montre l’ensemble de l’installation, y compris le tube de centrifugation avec une seringue fixée à son couvercle modifié. L’image en haut à droite montre un couvercle avec un petit trou pour l’embout de la seringue, tandis que l’image en bas à droite montre un couvercle avec une ouverture carrée pour un positionnement stable de la seringue. Le tube de centrifugation est pré-rempli de 10 ml de solution de chlorure de calcium, ce qui permet à la solution d’alginate sortant de l’extrémité de la seringue de subir une gélification, formant des boules de gel d’alginate. (C) Image microscopique représentative montrant la morphologie des billes de gel d’alginate. (D) Image microscopique représentative montrant la morphologie des boules de gel d’alginate contenant des cellules HeLa. Barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig4.jpg"> 
Figure 4 : Représentation schématique des étapes de préparation pour la mesure RMN et l’hyperpolarisation. Au cours du processus de construction DNP de ~60 minutes, la configuration NMR est effectuée en parallèle pour minimiser les retards. La préparation implique le chargement de billes d’alginate dans le tube RMN, suivi d’un réglage de verrouillage 1H, d’un calage et d’un réglage de la sonde pour s’assurer que le système est prêt pour une mesure immédiate. Après dissolution et mélange in situ, la spectroscopie RMN 13C résolue en temps révèle des pics clairs de pyruvate et de lactate. Les pics observés à environ 171 ppm, 179 ppm et 183 ppm correspondent respectivement au pyruvate, à l’hydrate de pyruvate et au lactate. Environ 4 × 107 cellules HeLa encapsulées dans un gel d’alginate ont été utilisées pour la mesure RMN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig5.jpg"> 
Figure 5 : Détection résolue dans le temps des signaux de pyruvate et de lactate lors de mesures répétées. Des spectres RMN 13C hyperpolarisés du même échantillon encapsulé dans des cellules SCCVII ont été acquis à des intervalles de 1,5 heure afin d’évaluer la faisabilité de mesures non destructives répétées. Les intensités maximales de pyruvate (cercles ouverts) et de lactate (cercles remplis, à l’échelle de 1000×) sont tracées au fil du temps pour chaque acquisition. (A) Première mesure. (B) La deuxième mesure, après 1,5 h, révèle une réduction marquée de la production de lactate. (C) La troisième mesure, après 1,5 heure supplémentaire, a confirmé une faible activité métabolique soutenue. L’analyse quantitative basée sur l’aire sous la courbe (AUC) a montré que le rapport [Lactate]/[Pyruvate] a diminué de 0,00134 (première mesure) à 0,00019 (deuxième) et 0,00027 (troisième). La concentration finale de cellules dans le gel d’alginate était d’environ 1,0 × 107 cellules/mL (4 × 107 cellules dans 4 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig6.jpg"> 
Figure 6 : Conversion du pyruvate en lactate dans les cellules HeLa. Des signaux RMN 13C hyperpolarisés résolus dans le temps du pyruvate et du lactate ont été mesurés dans des cellules HeLa vivantes. L’intensité du signal pyruvate est normalisée à sa valeur maximale au temps zéro. L’intensité du signal de lactate est mise à l’échelle d’un facteur de 103 pour la visibilité. L’analyse quantitative basée sur l’aire sous la courbe (AUC) a montré un rapport [Lactate]/[Pyruvate] de 0,00121. La concentration finale de cellules dans le gel d’alginate était d’environ 7,5 × 106 cellules/mL (3 × 107 cellules dans 4 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a> 
Figure supplémentaire 1. Images représentatives du septum de la fiole utilisé dans le système du bioréacteur. (A) Septum en silicone/PTFE (9 mm de diamètre) avant utilisation. (B) Le même septum en utilisation réelle, avec un tube en PEEK inséré dans des trous perforés. L’élasticité du matériau du septum lui permet de se refermer autour du tube, maintenant des conditions d’étanchéité à l’air lors de l’injection de substrat hyperpolarisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S1.tif" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure</a>
Figure supplémentaire 2 : Spectre RMN 13C hyperpolarisé résolu dans le temps acquis après mélange externe. Spectre représentatif résolu dans le temps du métabolisme du pyruvate [1-13°C] mesuré à l’aide d’un système RMN de paillasse après mélange externe de pyruvate hyperpolarisé et de cellules à l’extérieur du tube RMN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S2_RE.tif" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure</a>
Dossier supplémentaire 1 : Conception CAO du support cylindrique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Supplementary%20file%201_RE.ipt" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier</a>

Détection métabolique en temps réel dans des cellules vivantes à l’aide de la RMN 13C hyperpolarisée

The protocol presents a method to integrate an in-house-built bioreactor system with hyperpolarized 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to ...

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L’amélioration de la sensibilité fournie par la polarisation nucléaire dynamique de dissolution (DNP) permet de suivre les processus métaboliques en temps réel par RMN et IRM. Les caractéristiques et les performances d’une configuration DNP de dissolution dédiée conçue pour l’étude des réactions enzymatiques sont discutées.

Dissolution Polarisation Dynamique Nucléaire Instrumentation pour en temps réel la vitesse de réaction enzymatique mesures par RMN

Un fantôme dynamique à plusieurs compartiments est utilisé pour simuler une biologie d’intérêt pour des études métaboliques utilisant des agents de résonance magnétique hyperpolarisés.

Utilisation d&#39;un multi-compartiment dynamique unique Enzyme Phantom pour les études de hyperpolarisé Agents de résonance magnétique

La polarisation nucléaire dynamique avec dissolution ultérieure de l’échantillon a permis d’étudier en temps réel le métabolisme dans les systèmes biologiques. Le [1-13-C]pyruvate hyperpolarisé a été utilisé pour étudier in vitro l’activité de la lactate déshydrogénase dans une lignée cellulaire de carcinome de la prostate.

hyperpolarisé 13 C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Nous présentons un protocole pour mesurer la dépendance de champ magnétique du temps de relaxation spin-lattice de 13composés C-enrichis, hyperpolarisés au moyen de la polarisation nucléaire dynamique, utilisant la relaxométrie champ-cycle rapide. Plus précisément, nous l'avons démontré avec [1-13C]pyruvate, mais le protocole pourrait être étendu à d'autres substrats hyperpolarisés.

Mesurer la dépendance au champ magnétique de relaxation spin-lattice de l'hyperpolarisé [1-13C]pyruvate

Ce protocole décrit la configuration d’un bioréacteur RMN pour maintenir les cellules humaines encapsulées viables jusqu’à 72 h, suivie de l’acquisition et de l’analyse de données RMN dans les cellules résolues dans le temps. La méthodologie est appliquée pour surveiller les interactions protéine-ligand intracellulaire en temps réel.

Surveillance des interactions protéine-ligand dans les cellules humaines par RMN quantitative intracellulaire en temps réel à l’aide d’un bioréacteur à haute densité cellulaire

Nous décrivons une configuration expérimentale pour administrer des métabolites hyperpolarisés marqués au 13C en mode de perfusion continue à un cœur de souris perfusé isolé. Une approche dédiée d’acquisition de 13C-RMN a permis de quantifier l’activité enzymatique métabolique en temps réel, et une analyse multiparamétrique 31P-RMN a permis de déterminer la teneur en ATP tissulaire et le pH.

Étude du métabolisme cardiaque dans le cœur de souris perfusé isolé avec spectroscopie RMN hyperpolarisée [1-13 C]pyruvate et 13C/31P

Imagerie de vie de fluorescence (FLIM) a émergé comme une technique essentielle pour l'image de l'environnement et l'interaction des protéines spécifiques et des colorants dans les cellules vivantes. FLIM des rotors moléculaires fluorescents permet de cartographier de la viscosité dans les cellules vivantes.

Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Nous avons développé un cytomètre en flux en utilisant des ultrasons pour détecter induite par laser circulant cellules de mélanome comme un indicateur précoce de la maladie métastatique.

Détection et isolement des cellules du mélanome de circulation à l&#39;aide Débitmétrie photoacoustique

Cet article démontre un protocole pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes au moyen de microindentation aide d'un microscope à force atomique (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Émissions des systèmes de séparation à double caméra pour deux couleurs microscopie à fluorescence générer en temps réel des séquences d'images avec une résolution optique et temporelle exceptionnelle, une exigence de certains tests cellulaires en direct, y compris des essais parallèles chambre d'écoulement de la plaque d'adhérence. Lorsque le logiciel est utilisé pour fusionner des images de canaux d'émission acquis simultanément, des séquences d'images pseudocolored sont produites.

Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d&#39;émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l&#39;adhésion cellulaire

Découvrez la mesure du métabolisme du pyruvate en temps réel dans des cellules vivantes par RMN ¹³C hyperpolarisée. Cette méthode améliore la reproductibilité pour les études métaboliques et le criblage de médicaments.

Détection métabolique en temps réel dans des cellules vivantes à l’aide de la RMN ¹³C hyperpolarisée

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