Détection métabolique en temps réel dans des cellules vivantes à l’aide de la RMN ¹³C hyperpolarisée

Nous avons développé une méthode non invasive pour mesurer le métabolisme sérique en temps réel à l’aide de techniques avancées de RMN hyperpolarisée. Notre objectif est de créer des outils accessibles pour diverses applications de recherche biologique. Plusieurs systèmes RMN hyperpolarisés pour le métabolisme sérique ont été rapportés. Cependant, il n’existait pas jusqu’à présent de protocoles standardisés et reproductibles pour une mise en œuvre plus large de la recherche.

Notre protocole améliore l’accessibilité à l’aide de composants disponibles dans le commerce. Nous fournissons également une validation complète, y compris les avantages du mélange du système et les capacités de mesure répétées pour une adaptation plus large. Nos résultats permettent de suivre en temps réel les changements métaboliques dynamiques dans les cellules vivantes sans distraction. Cela ouvre de nouvelles possibilités pour des études de médicaments à long terme dans diverses applications de sondes métaboliques.

Notre approche comporte des limites, notamment des options de sondage et des exigences d’automatisation. La résolution de ces défis permettra d’établir des techniques de mesure métabolique cellulaire et d’enrichir les efforts de recherche de notre laboratoire sur le DNP à l’avenir.

[Narrateur] Pour commencer, ajoutez deux millilitres de solution de trypsine EDTA à 0,25 % de volume à volume dans une boîte de 10 centimètres. Inclinez doucement le plat pour vous assurer que toute la surface est couverte. Aspirez ensuite l’excès de trypsine éthylènediaminetétracetique solution d’acide tracetique. Placez le plat dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et incubez pendant deux minutes. Ajoutez ensuite 10 millilitres de milieu de culture dans le plat. À l’aide d’une pipette, pipetez doucement de haut en bas pour détacher les cellules de la surface et recueillir toute la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Maintenant, prenez environ 10 microlitres de suspension de cellules et chargez-les dans un compteur de cellules pour déterminer le nombre de cellules. Assurez-vous que le comptage mesuré confirme un rendement d’environ 10 millions de cellules ou ajustez si nécessaire. Centrifugez la suspension cellulaire restante à 120 x g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, aspirez et jetez le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire obtenue dans quatre millilitres de solution d’alginate poids/volume à 2 % et pipetez lentement pour minimiser la formation de bulles. Ajoutez maintenant 10 millilitres de solution de chlorure de calcium de 50 millimolaires dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Fixez la seringue au capuchon du tube à centrifuger contenant la solution de chlorure de calcium. Prélevez 300 microlitres du mélange d’alginate cellulaire dans une seringue de 0,5 millilitre munie d’une aiguille de 10 millimètres de calibre trois. Fermez ensuite hermétiquement le tube de centrifugation avec la seringue fixée au bouchon, et placez l’ensemble dans la centrifugeuse pour qu’il tourne doucement à 200 x g pendant cinq minutes. Retirer le surnageant après la centrifugation et remettre en suspension le gel obtenu dans le milieu de culture. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférez le gel encapsulé dans une cellule dans un tube RMN et insérez l’éponge pour assurer une fermeture étanche. Préchauffez le réservoir moyen contenant 5 % d’oxyde de deutérium volume à volume dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Commencer la circulation à un rythme d’environ 500 microlitres par heure pour stabiliser les conditions. Inspectez la configuration pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites avant de continuer. Ajouter 18 microlitres d’acide pyruvique marqué au carbone 13 à une concentration de 14,2 molaires dopée à 25 millimolaires d’OX063 dans un flacon d’échantillon. Connectez le flacon au trajet du fluide du système de polarisation nucléaire dynamique. Ensuite, insérez le flacon connecté dans l’unité d’alésage du polariseur nucléaire dynamique. Appliquer un rayonnement micro-ondes à environ 188 gigahertz avec une puissance de 22 milliwatts pendant une durée de 60 à 80 minutes. Utilisez le spectromètre à résonance magnétique nucléaire à l’état solide intégré au système de polarisation nucléaire dynamique pour surveiller l’intensité du signal au carbone 13. Enregistrez les données du signal toutes les cinq minutes à l’aide du logiciel de contrôle du système. Dissoudre maintenant rapidement l’échantillon polarisé dans 3,2 millilitres de tampon de dissolution préchauffé à la température biologique. Chargez l’échantillon préparé dans un tube RMN et insérez-le dans le spectromètre. Sur la console RMN, lancez la procédure automatisée pour effectuer le verrouillage, le réglage, l’appariement et le calage avec l’échantillon en place afin d’assurer une résolution spectrale et une stabilité du signal optimales. Chargez une séquence d’acquisition d’impulsions en carbone 13 avec découplage de protons activé à l’aide d’un réglage tel que 13-CPD. Réglez l’angle de retournement à 90 degrés avec une impulsion d’une microseconde étiquetée P1. Ensuite, définissez le temps d’acquisition à 1,376 seconde, la largeur spectrale à 23 663 hertz et les points d’acquisition, ou TD, à 65 536. Réglez le délai de relaxation D1 sur zéro seconde. Attribuez 150 incréments de temps à TD1 pour l’acquisition de 150 spectres séquentiels en mode pseudo-2 dimensions, et ajustez le gain du récepteur à une valeur faible, telle qu’environ un, pour éviter la saturation du signal causée par les échantillons hyperpolarisés. Arrêtez maintenant la pompe péristaltique pour arrêter temporairement la circulation du fluide avant d’injecter la solution hyperpolarisée à travers la tubulure d’entrée. Commencer l’acquisition spectrale environ 10 secondes avant de dissoudre le substrat hyperpolarisé pour assurer la capture du signal à l’arrivée sur le site de détection. Lorsque la solution sort du polariseur à polarisation nucléaire dynamique, aspirez un millilitre de celle-ci dans une seringue. Basculez la vanne à trois voies à l’entrée du bioréacteur en position B pour diriger la solution hyperpolarisée dans le tube RMN. Une fois l’injection terminée, remettez la vanne en position A pour reprendre la circulation du fluide et éviter tout reflux. Enfin, confirmez que l’injection a réussi après avoir noté une augmentation du signal de décroissance à induction libre sur le logiciel d’acquisition. Assurez-vous que la solution finale atteint une température comprise entre 308 et 313 Kelvin et un pH d’environ sept avant de la transférer pour la mesure RMN. Des spectres RMN hyperpolarisés au carbone 13 du même échantillon encapsulé de cellules SCCVII ont été acquis à des intervalles de 1,5 heure afin d’évaluer la faisabilité de mesures non destructives répétées. La première mesure RMN a montré une augmentation marquée du signal de lactate, indiquant une conversion métabolique active du pyruvate en lactate. Des mesures ultérieures à des intervalles de 1,5 heure ont révélé une réduction progressive de l’intensité du signal de lactate, indiquant une diminution de l’activité métabolique au fil du temps. Dans les cellules HeLa, les premières mesures ont confirmé la conversion réussie du pyruvate en lactate avec des pics de signal clairement discernables. Bien que le signal ait diminué progressivement en raison de la relaxation T2, le rapport signal/bruit est resté adéquat tout au long de l’acquisition de 60 secondes, ce qui suggère que le protocole actuel est largement applicable et peut servir d’outil polyvalent pour le profilage métabolique en temps réel dans divers types de cellules.