Germination asymbiotique et régénération par explant foliaire de l’orchidée médicinale en voie de disparition Hemipilia cucullata à partir de graines matures

Mes recherches portent sur l’optimisation des protocoles de culture tissulaire pour les orchidées en voie de disparition afin d’améliorer la conservation, la propagation à grande échelle et l’utilisation durable de ces précieuses plantes médicinales. Un défi majeur est d’obtenir des taux de germination et de régénération constants entre les espèces d’orchidées, car chacune nécessite une optimisation des milieux spécifique à l’espèce et un contrôle précis des conditions de croissance. Nous avons développé des protocoles efficaces de culture de tissus pour de multiples plantes menacées, permettant le rétablissement des espèces et soutenant la reconstruction dans des habitats naturels.

Il n’existe aucun système efficace de culture tissulaire reproductible pour la manipulation, la propagation, la restauration et la conservation d’Hemipilia cucullata. Les orchidées terrestres ont souvent besoin de champignons symbiotiques spécifiques dont l’isolement et l’identification sont complexes. Une méthode symbiotique simplifie la propagation et contourne ces étapes.

Notre pratique permet une germination élevée et la régénération rapide des plantes à partir de l’état mature, éliminant ainsi la dépendance fongique et offrant une approche plus rapide et plus fiable pour la propagation d’Hemipilia cucullata. Pour commencer, placez la capsule dans un bécher. Ajoutez une à deux gouttes de détergent dans le bécher pour le rinçage.

Lavez la capsule sous l’eau courante du robinet pendant cinq minutes. Ensuite, à l’aide d’un papier absorbant stérile, retirez l’eau de surface restante de la capsule. Maintenant, plongez la capsule dans de l’éthanol à 75 % pendant 30 secondes.

Stérilisez la capsule en l’immergeant dans 50 millilitres d’une solution d’hypochlorite de sodium à 20 % contenant environ 5 % de chlore disponible. Ajoutez ensuite deux gouttes de détergent à vaisselle ménager non dilué à la solution et incubez la capsule pendant 10 à 12 minutes. Rincez la capsule cinq fois avec de l’eau distillée stérile pour éliminer tout désinfectant résiduel.

Ensuite, à l’aide d’un scalpel stérile, retirez environ un millimètre de l’apex et des extrémités du pédicelle de la capsule. Faites une petite incision à l’extrémité supérieure de la capsule pour exposer les graines et les recueillir dans une boîte de Pétri stérile. À l’aide d’une pince stérile, dispersez uniformément environ 500 à 600 graines dans chaque bouteille de culture contenant le milieu préparé.

Laissez les graines absorber l’eau et se déposer au fond du milieu liquide. Maintenez les cultures à 25 degrés Celsius avec un cycle de lumière et d’obscurité de 12 heures et une intensité lumineuse de 36 micromoles par mètre carré et par seconde. Observez la germination des graines chaque semaine.

Enregistrez tout changement morphologique visible et photographiez les cultures pour documenter. Choisissez des plantules saines d’un à deux centimètres sans noircissement visible ni jaunissement complet pour l’élongation des pousses. À l’aide d’une pince stérilisée et refroidie, transférez aseptiquement 8 à 12 plantules dans chaque bouteille contenant un milieu d’élongation de pousse fraîchement préparé.

Répartissez uniformément les plantules dans chaque bouteille. Après cinq semaines d’élongation des pousses, sélectionnez les plantules avec des pousses complètement développées et des feuilles saines pour l’échantillonnage des explants de feuilles. Exciser les feuilles stériles complètement expansées d’une plantule saine à l’aide du scalpel stérile.

Retirez la région apicale et les bords des feuilles. Ensuite, coupez chaque feuille en segments d’environ 0,5 par 0,5 centimètre à l’aide d’un scalpel stérile dans des conditions aseptiques. Placez 10 segments de feuilles sur le milieu d’induction PLB avec la surface adaxiale vers le haut.

Assurez-vous que chaque segment touche fermement le support. Ensuite, cultivez-les pendant cinq semaines. Enfin, évaluez le nombre de PLB induites avec succès et calculez le taux d’induction en pourcentage.

Enregistrez la hauteur moyenne des bourgeons en centimètres et comptez le nombre de bourgeons formés par explantation. La germination des graines en milieu liquide était visiblement caractérisée par l’émergence d’embryons verts à partir du tégument de la graine à environ 60 jours, qui formaient ensuite des protobulbes sphériques à 80 à 85 jours. Le taux de germination le plus élevé de 72 % a été atteint dans un milieu liquide complété par 0,5 milligramme par litre d’ANA.

Le milieu B5 contenant 0,5 milligramme par litre de benzyladénine et 0,2 milligramme par litre de NAA a donné le taux de prolifération de protocormes le plus élevé, avec une moyenne de 5,3 protocormes nouvellement formés par explant. Les protobulbes cultivés dans un milieu B5 avec la combinaison optimisée de régulateurs de croissance ont montré une croissance vigoureuse et une pigmentation verte saine, surpassant ceux cultivés sur un milieu MS dans les mêmes conditions. Le plus grand nombre de branches par plantule, soit en moyenne quatre, a été observé avec un milligramme par litre de benzyladénine et d’ANA, suivi de près par l’ANA seul à 0,5 milligramme par litre.

L’allongement des pousses a été le plus amélioré avec la combinaison de 0,5 milligramme par litre de benzyladénine et d’un milligramme par litre d’ANA, ce qui a donné une hauteur moyenne de plantule de 4,8 centimètres. Le taux d’induction le plus élevé de corps de type protocorme (44,3 %) a été obtenu en utilisant trois milligrammes par litre de benzyladénine et 0,2 milligramme par litre d’ANA.