Caractérisation par imagerie en direct des mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique mâle chez Arabidopsis thaliana

Nos recherches explorent la méiose végétale, visant à découvrir les mécanismes moléculaires guidant la reconnaissance, l’alignement et l’appariement des chromosomes homologues lors de la progression méiotique. Le défi consiste à visualiser le mouvement des chromosomes dans les profils méiotiques, nécessitant une imagerie tissulaire vivante avec haute résolution et rapidité pour suivre les trajectoires. Pour commencer, retirez le film protecteur de l’entretoise d’un côté et placez-le au centre d’une culasse en verre.

Ensuite, retirez le second film protecteur. Déposez huit microlitres d’eau du robinet au centre de l’espaceur. À l’aide de pinces, cueillez une inflorescence sur l’une des tiges principales.

Placez l’inflorescence sur une nouvelle lame placée sous un microscope stéréo muni d’une règle. Sélectionnez des bourgeons floraux mesurant environ 0,5 millimètre de long. À l’aide d’aiguilles acérées, ouvrez doucement les bourgeons en écartant les sépales et les pétales pour ne conserver que les anthères.

Transférez délicatement les grappes anthhériques dans l’eau de la cavité des entretoises immédiatement après avoir retiré les sépales et pétales pour éviter la déshydratation. Déposez plusieurs autres grappes à l’intérieur de la cavité de l’espaceur. Pour recouvrir la lame avec une gaine de couverture tout en évitant les bulles d’air, ajoutez huit microlitres d’eau sur une gaine de couverture.

Ensuite, inversez délicatement la couche de couvercle en faisant face à la cavité de l’espaceur. Assurez-vous que les grappes anthères sont immergées dans un total de 16 microlitres d’eau, et que le couvercle adhère bien à l’espaceur. Installez le microscope en excitant la GFP à 488 nanomètres et en la détectant avec un détecteur hybride entre 494 et 547 nanomètres.

Ensuite, localisez l’anthère en utilisant l’éclairage en champ clair. En utilisant le canal du champ clair, déterminez le stade méiotique en fonction de la forme des cellules. Visualisez l’anthère sur le logiciel et utilisez le signal RFP comme indicateur supplémentaire du stade méiotique des cellules.

Pour effectuer des acquisitions continues, réglez l’intervalle de temps à zéro dans la section de temps. Ensuite, utilisez le module de spots pour suivre automatiquement les spots. Choisissez le canal source vert et réglez le diamètre XY à un micromètre pour le centromère marqué GFPCENH3.

Ensuite, modifiez la qualité de la détection en fonction de l’intensité du signal à l’aide du graphique en bas de la fenêtre de contrôle. Utilisez l’algorithme de suivi automatique du mouvement régressif pour tracer les trajectoires des centromères et visualiser toutes les trajectoires afin de distinguer facilement les méiocytes des tissus somatiques. Ensuite, utilisez le module de points pour suivre les points au fil du temps sur le noyau sélectionné.

Définissez une région d’intérêt en sélectionnant le segment d’option uniquement comme une région d’intérêt et effectuez un suivi spot en son sein. Sélectionnez une région d’intérêt qui inclut correctement le noyau dans les trois dimensions et dans le temps. Dans un graphique de lignée, utilisez le visualiseur 3D du logiciel pour visualiser toutes les trajectoires.

Supprimez les trajectoires en dehors du méiocyte analysé en les sélectionnant et en appuyant sur la touche supp du clavier. En mode édition, supprimez ou ajoutez un objet, en veillant à ce que l’objet soit ajouté dans le bon plan. En mode édition de pistes, connectez manuellement les nouveaux objets sur le graphique de lignée après avoir analysé la cellule en 3D en profondeur.

Calculez la vitesse instantanée à chaque pas de temps pour surveiller les variations de la vitesse de mouvement au fil du temps. Calculez l’angle de rotation comme le changement de direction du mouvement entre des pas de temps consécutifs afin de révéler les motifs de trajectoire. Stockez le résultat avec la vitesse instantanée.

Calculez le ratio de diffusion à l’aide d’un cell tracker pour mesurer la distance d’un objet suivi par rapport à sa position de départ, indiquant un comportement exploratoire. Calculer la vitesse moyenne de chaque piste afin de résumer les caractéristiques de mouvement sur la période d’observation. Calculez l’angle moyen de braquage par voie pour analyser le mouvement, la directionnalité et les comportements, puis stockez le résultat.

Ensuite, calculez la taille du centroïde à chaque pas de temps pour mesurer la dispersion spatiale des centromères autour de leur position moyenne. Utilisez les variations de taille du centroïde au fil du temps pour évaluer la cohérence globale entre les pistes du centromère et stocker le résultat. Calculer la corrélation croisée de vitesse pour analyser les relations entre la dynamique de mouvement des différents objets suivis, révélant ainsi des comportements coordonnés potentiels.

Calculons ensuite le déplacement carré moyen pour chaque piste afin de quantifier la distance carrée moyenne parcourue par les centromères sur un intervalle de temps donné. Les centromères méiotiques ont affiché une vitesse moyenne significativement plus élevée, de 109,35 nanomètres par seconde, comparée aux centromères somatiques. Les centromères méiotiques ont montré une gamme plus large et un rapport de diffusion normalisé plus élevé que les centromères somatiques.

La répartition des angles de rotation différait entre les centromères méiotiques et somatiques. Le déplacement carré moyen des centromères méiotiques a augmenté avec le temps tandis que les centromères somatiques sont restés largement stables. Ce protocole a permis la première quantification du mouvement des chromosomes méiotiques chez Arabidopsis, révélant une dynamique spectaculaire des centromères lors des stades zygotène et pachytène.

Ce protocole permet d’étudier les mouvements des régions génomiques pendant la prophase méiotique et peut être adapté pour une application dans d’autres espèces végétales. Ces travaux permettent d’explorer le mouvement des chromosomes et l’interaction de recombinaison, approfondissant la compréhension des mécanismes qui favorisent la diversité génétique lors de la formation des gamètes des plantes.