Name: Surexpression et purification d’une nucléase toxique d’Escherichia coli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Apprenez la surexpression et la purification de la nucléase toxique Nsp15 d'Escherichia coli C41(DE3) par chromatographie d'affinité et d'exclusion stérique. Cette méthode permet d'étudier les nucléases virales pour des applications thérapeutiques.

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<ol><li>Francis, D. M., Page, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+optimize+protein+expression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies to optimize protein expression in E. coli.</a> Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).</li>
<li>Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicity+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%3A+a+comparison+of+overexpression+in+BL21%28DE3%29%2C+C41%28DE3%29%2C+and+C43%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3).</a> Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li>
<li>Kato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+low+leakage+expression+systems+using+dual+transcriptional-translational+control+for+toxic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).</li>
<li>Dubendorf, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+lysozyme+to+improve+an+inducible+T7+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system.</a> J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-convoluting+the+genetic+adaptations+of+E.+coli+C41%28DE3%29+in+real+time+reveals+how+alleviating+protein+production+stress+improves+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields.</a> Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).</li>
<li>James, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+over-expression+in+Escherichia+coli+triggers+adaptation+analogous+to+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance.</a> Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+the+endoribonuclease+function+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+nsp11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11.</a> J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).</li>
<li>Nedialkova, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+arterivirus+nonstructural+protein+11+reveals+the+nidovirus-wide+conservation+of+a+replicative+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease.</a> J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+endoribonuclease+ensures+efficient+viral+replication+and+prevents+protein+kinase+R+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation.</a> J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).</li>
<li>Joseph, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+monomeric+form+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endonuclease+nsp15+suggests+a+role+for+hexamerization+as+an+allosteric+switch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch.</a> J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+for+endoribonuclease+nsp15-mediated+regulation+of+alpha-coronavirus+propagation+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence.</a> Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).</li>
<li>Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+SARS+virus+nsp15+endoribonuclease%3A+identification+of+residues+affecting+hexamer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiviral+target+revealed+by+the+hexameric+structure+of+mouse+hepatitis+virus+nonstructural+protein+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15.</a> J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endoribonuclease+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15.</a> J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).</li>
<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+SARS-CoV-2+endoribonuclease+nsp15+reveal+insight+into+nuclease+specificity+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics.</a> Nat Commun. 12 (1), 636(2021).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+nsp15+endoribonuclease+NendoU+from+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2.</a> Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).</li>
<li>Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+on+Co2%2B+carboxymethylaspartate-agarose+Superflow%2C+as+demonstrated+by+one-step+purification+of+lactate+dehydrogenase+from+chicken+breast+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Appl+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle.</a> Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).</li>
<li>Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turkey+coronavirus+non-structure+protein+NSP15+-+an+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease.</a> Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).</li>
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<li>Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+highly+toxic+genes+in+E.+coli%3A+special+strategies+and+genetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools.</a> Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).</li>
<li>Godoy, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+and+crystallographic+fragment+screening+of+SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).</li>
<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease+antagonizes+dsRNA-induced+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).</li>
<li>Wang, X., Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+preferentially+degrades+AU-rich+dsRNA+via+its+dsRNA+nickase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).</li>
<li>Zheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+evolution+of+nidovirus+endoribonuclease+based+on+the+finding+that+nsp15+from+porcine+deltacoronavirus+functions+as+a+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer.</a> J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).</li>
<li>Huang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+RNA+cleavage+by+coronavirus+nsp15+endonuclease%3A+evidence+for+acid-base+catalysis+and+substrate-dependent+metal+ion+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation.</a> J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characterization+of+endoribonuclease+nsp15+encoded+by+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus.</a> J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).</li>
<li>Jernigan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+structural+studies+of+SARS-CoV-2+protein+NendoU+with+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser.</a> Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).</li>
<li>Ricagno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+nsp15+from+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).</li>
<li>Canal, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+SARS-CoV-2+antiviral+compounds+by+screening+for+small+molecule+inhibitors+of+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease.</a> Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).</li>
<li>Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+nsp15+protein+is+an+endoribonuclease+that+prefers+manganese+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor.</a> J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).</li>
<li>De Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+successful+recombinant+expression+of+disulfide+bond-dependent+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli.</a> Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; m PES, stérilisant, faible liaison protéique, système de filtration, 1 L</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la sérine protéase AEBSF</td><td>Goldbio</td><td>30827-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Gélose bactériologique</td><td>Amresco</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>&Auml ; Système de purification KTA go</td><td>Cytiva</td><td>29383015</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline sodique</td><td>Goldbio</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>Fioles agitées à chicanes</td><td>Nalgene&nbsp ;</td><td>F0527</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>Référence 5920R</td><td></td></tr><tr><td>BioPhotomètre plus</td><td>Eppendorf</td><td>E-BP6132</td><td></td></tr><tr><td>Thrombine bovine</td><td>BioPharm</td><td>91-030</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de colorant Bradford</td><td>Boston BioProducts</td><td>BPA-200</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114931</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bain sec numérique</td><td>Bio Rad</td><td>1660562</td><td></td></tr><tr><td>Écarteurs jetables, en forme de L</td><td>Partenaires MedSupply</td><td>62-1014-1</td><td></td></tr><tr><td>Le dithiothréitol</td><td>Goldbio</td><td>27565-41-9</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI à partir du pancre bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Broyeur de mouchoirs Douce, 40 mL</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de chromagtographie à colonne économique</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1532</td><td></td></tr><tr><td>Pétrin à douilles Enduro minimix</td><td>Labnet</td><td>S0600</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25R Inc/Réf Agitateur</td><td>Eppendorf</td><td>NB-E25R</td><td></td></tr><tr><td>FastPette V2</td><td>Labnet</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor à angle fixe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>096-041075</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à angle fixe Fiberlite F21-8x50y</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>096-084275</td><td></td></tr><tr><td>Imageur Gel Doc EZ</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Alrich</td><td>Référence G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N° H3375</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur à plaque chauffante</td><td>VWR</td><td>12365-346</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>VWR</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Goldbio</td><td>N° I-902-25</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&szlig ;-D-thiogalactioside (IPTG)</td><td>Goldbio</td><td>Référence 12481C25</td><td></td></tr><tr><td>Cellules E. coli compétentes Lemo21(DE3)</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>Réf. C2528J</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de manganèse(II) tétrahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Référence M3634</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, 1,7 mL</td><td>Partenaires MedSupply</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>Cellule d’électrophorèse verticale mini-PROTEAN tetra</td><td>Bio-Rad</td><td>10025025</td><td></td></tr><tr><td>Gels de tris-glycine mini-protéiformes, 4-20 %</td><td>Bio-Rad</td><td>4568094</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrfuge MyFuge</td><td>Partenaires MedSupply</td><td>Réf. C1008-B</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de centrifugeuse super-vitesse Nalgene 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3141-1006</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger Nalgene oak ridge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31139-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanophotomètre</td><td>Implen</td><td>3769</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur non secouant</td><td>Labnet</td><td>I 5110&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Surexprimer les cellules C41(DE3) chimiquement compétentes</td><td>Technologies de biorecherche</td><td>60442-1</td><td></td></tr><tr><td>Surexprimer les cellules C41(DE3) chimiquement compétentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMC0017</td><td>Abandonné; Les cellules Biosearch C41(DE3) ou NEB Lemo21 sont une alternative</td></tr><tr><td>Pétri</td><td>Partenaires MedSupply</td><td>62-1077-3</td><td></td></tr><tr><td>Plasmides (squelette pET-14b)</td><td>Rédacteur</td><td>Commande personnalisée</td><td></td></tr><tr><td>Micro-cuvettes en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>PowerPacalimentation universelle</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de glissement de précision</td><td>Becton Dixon</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Normes de précision et non colorées de protéines</td><td>Bio-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’expression de récupération&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMR0001K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à godets oscillants S-4x1000</td><td>Eppendorf</td><td>EP-S4X1</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, 10 mL</td><td>Faclon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, 25 mL</td><td>Faclon</td><td>35725</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, 5 mL</td><td>Faclon</td><td>35743</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique, 50 mL</td><td>Pr1ma</td><td>PR-Sero-50</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. S9888</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Démantravateur sonique</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall Lynx 4000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Spephadex G-25 M-10</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>&szlig ;-Mercaptoéthanol</td><td>Millipore</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>Bécher Griffin en acier inoxydable</td><td>Vaisselle polaire</td><td>Référence 13977-010-EA</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon stériles, 15 mL</td><td>Faucon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon stériles, 50 mL</td><td>Faucon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Superdex 200 10/300 GL</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Seringues, 1 mL</td><td>Air-Tite&nbsp ;</td><td>N° A1</td><td></td></tr><tr><td>Seringues, 3 mL</td><td>Becton Dixon</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Résine d’affinité métallique TALON</td><td>Takara</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Cure-dents</td><td>Rue de la créativité</td><td>PAC3690-01</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Goldbio</td><td>T-400-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biomédical</td><td>807423</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Produits de recherche internationale</td><td>Réf. T60065</td><td></td></tr><tr><td>Vornado</td><td>Point de référence</td><td>BV101-G</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Produits de recherche internationale</td><td>Y20025</td><td></td></tr></tbody></table>

surexpression et purification d’une nucléase toxique d’escherichia coli

Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

En raison de la toxicité de Nsp15 en tant que nucléase, un total de ~7 h était généralement nécessaire pour que les cultures de démarrage atteignent une DO600 de 0,8-1,0. Une fois inoculé, un total de ~3 à 5 h était généralement nécessaire pour la même DOoptimale de 600 de 0,8 à 1,0 pour l’induction. Dans ce cas, le temps de doublement semblait être de ~1 h. Lorsqu’un mutant catalytiquement mort de Nsp15 a été exprimé, le doublement des cellules E. coli est apparu normal (~20 min), preuve s...

Surexpression et purification d’une nucléase toxique d’Escherichia coli

Escherichia coli has been widely employed as an expression system to produce recombinant proteins. Yet some types of recombinant proteins, such as ...

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Transduction des protéines permet la livraison directe de protéines biologiquement actives dans les cellules. Contrairement aux méthodes conventionnelles telles que la transfection d'ADN ou de transduction virale ce paradigme non invasive permet une manipulation très efficace cellulaires de façon titrable contourner la toxicité cellulaire et le risque de transformation oncogénique par modification génétique permanente.

Ingénierie cellulaire perméable protéines

Systématiques et à grande échelle de synthèse génétiques écrans d'interaction gène-gène (ou épistasie) peut être utilisé pour explorer la redondance génétique et la voie de la diaphonie. Ici, nous décrivons un haut débit quantitatif synthétique de la technologie génétique de dépistage tableau, appelé ESGA que nous avons développé pour élucider les relations épistatiques et l'exploration des réseaux d'interactions...

La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Les exonucléases jouent un rôle essentiel pour assurer la stabilité du génome. La perte de la fonction de l’exonucléase WRN entraîne un vieillissement prématuré. L’étude des substrats et d’autres exigences de la nucléase in vitro peut aider à élucider son rôle in vivo. Ici, nous démontrons un test rapide et reproductible basé sur la fluorescence pour mesurer son activité nucléase.

Un Exonuclease analyse basée sur la fluorescence pour caractériser DmWRNexo, orthologue humain progéroïde WRN Exonuclease, et son application à d&#39;autres nucléases

Ce protocole de cinq jours décrit toutes les étapes, de l'équipement et des logiciels supplémentaires nécessaires pour la création et l'exécution d'une Escherichia coli endogène efficace basé TX-TL système d'expression acellulaire à partir de zéro. Avec des réactifs, le protocole prend 8 heures ou moins de configurer une réaction, collecter et traiter les données.

Protocoles pour la mise en œuvre d'un Escherichia coli Sur la base du système d'expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

La co-expression des protéines est une alternative puissante à la reconstitution in vitro de complexes protéiques, et est d’une aide pour réaliser des tests biochimiques et génétiques in vivo. Ici, nous rapportons l’utilisation de la co-expression protéique chez Escherichia coli pour obtenir des complexes protéiques et pour ajuster la fréquence de mutation des cellules.

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

Procédé à rendement élevé pour une étape de purification du recombinant négatif Helicobacter pylori protéine d' activation des neutrophiles (HP-NAP) surexprimé dans Escherichia coli en utilisant des résines de diéthylaminoéthyle en mode discontinu est décrit. HP-NAP purifié par cette méthode est bénéfique pour le développement de vaccins, de médicaments ou de diagnostic pour H. pylori -Associated maladies.

Une étape négative de purification chromatographique<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En mode batch

Un protocole simple pour la surexpression et la purification de la cis- prényltransférase humaine optimisée par codon, dans des conditions non dénaturantes, d' Escherichia   Coli , est décrit, avec un dosage d'activité enzymatique. Ce protocole peut être généralisé pour la production d'autres protéines de cis- prenyltransférase en quantité et en qualité adaptées aux études mécanistiques.

La surexpression et la purification de l'être humain Cis -prenyltransférase dans Escherichia coli

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation des préexistants de résistance aux antibiotiques-cassette suppression des constructions comme base pour l’établissement des mutants de délétion dans autres souches d’e. coli . Ces mutations de délétion peuvent être mobilisées et insérées dans le locus correspondant d’une souche à l’aide de transduction bactériophage P1.

Produisant des destructions de gène chez Escherichia coli par Transduction P1 avec des Cassettes de la résistance aux antibiotiques soumis à accises

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) peut enzymatiquement enlever l'oxygène diatomique libre d'un système aqueux utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA). Ce protocole décrit l'expression, la purification, et l'analyse d'activité de cette enzyme de récupération d'oxygène.

Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase

Des endonucleases de restriction avec une nouvelle spécificité de séquence peuvent être développées à partir d’enzymes reconnaissant une séquence partiellement dégénérée. Ici, nous fournissons un protocole détaillé que nous avons utilisé avec succès pour modifier la spécificité de la séquence de l’enzyme NlaIV. Les ingrédients clés du protocole sont la compartimentation in vitro de la réaction de transcription/traduction et la sélection de variantes avec de nouvelles spécificités séquences.

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Les bactéries sécrètent des vésicules extracellulaires (VE) de taille nanométrique transportant des molécules biologiques bioactives. La recherche sur les véhicules électriques se concentre sur la compréhension de leur biogenèse, de leur rôle dans les interactions microbes-microbes et hôte-microbe et des maladies, ainsi que de leurs applications thérapeutiques potentielles. Un flux de travail pour l’isolation évolutive des véhicules électriques de diverses bactéries est présenté pour faciliter...

Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Apprenez la surexpression et la purification de la nucléase toxique Nsp15 d'Escherichia coli C41(DE3) par chromatographie d'affinité et d'exclusion stérique. Cette méthode permet d'étudier les nucléases virales pour des applications thérapeutiques.

Surexpression et purification d’une nucléase toxique d’Escherichia coli

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