Extraction d’histones à partir d’échantillons cliniques pour le profilage épigénétique par spectrométrie de masse

Le champ de notre recherche est d’analyser les changements épigénétiques dans les échantillons de cancer, de découvrir de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques, et d’identifier des cibles potentielles pour la thérapie. Un défi majeur avec les échantillons cliniques est la quantité limitée de matériaux et les artefacts induits par la fixation. Cependant, grâce à notre flux de travail optimisé et à notre EM de sensibilité di, nous pouvons quantifier jusqu’à 50 PTM d’histones à partir de seulement 1000 cellules.

Nous montrons que la spectrométrie de masse peut quantifier les changements de PTM des histones dans un échantillon clinique, offrant ainsi un aperçu du mécanisme épigénétique et permettant la découverte de biomarqueurs et l’identification de cibles médicamenteuses pour des thérapies épigénétiques de précision. Notre protocole répond à la nécessité d’un profilage robuste, quantitatif et sensible sur la PTM des histones dans divers types d’échantillons cliniques. La spectrométrie de masse est idéale pour l’analyse PTM des histones, offrant une détection non biaisée, un profilage simultané et une co-occurrence sur le même peptide, surmontant ainsi les limites des méthodes basées sur les anticorps.

Pour commencer, décongelez le tissu frais et gelé sur de la glace et, à l’aide d’un scalpel ou d’une lame, coupez un morceau d’environ 20 à 30 milligrammes correspondant à environ deux millimètres cubes de tissu. Transférez l’échantillon de tissu coupé dans un tube de 1,5 millilitre. À l’aide de ciseaux, hachez le mouchoir en petits morceaux.

Ajoutez un millilitre de tampon d’isolation des noyaux fraîchement préparé, complété avec les inhibiteurs de protéase spécifiés, puis réduisez à nouveau le tissu. Transférez l’échantillon sur un homogénéiseur vers le bas. En utilisant d’abord le pilon lâche, puis le pilon serré, homogénéisez le tissu jusqu’à ce qu’aucun morceau visible ne reste à l’œil nu.

Filtrez l’échantillon homogénéisé à travers une passoire cellulaire de 100 micromètres pour éliminer les débris tissulaires. Pipettez vigoureusement l’échantillon filtré de haut en bas à l’aide d’une pipette de 200 microlitres pour dissoudre la membrane plasmique. Transférez l’échantillon dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.

Placez le tube dans une centrifugeuse sur table de travail et faites tourner à 2 300 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour pelleter les noyaux. Après avoir écarté le surnageant, il faut resuspendre la pastille nucléaire dans 50 à 100 microlitres de tampon d’isolation du noyau, complétés avec 0,1 % de SDS pour dissoudre la membrane nucléaire. Ajoutez ensuite 250 unités de nucléase de Benzonase à l’échantillon en suspension pour digérer les acides nucléiques.

Mélangez bien et faites éclore pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. Pour une température de coupe optimale, les échantillons congelés, lavez les tissus avec de l’eau éthanolienne et du PBS avant le haché et l’extraction des histones. Ajoutez un millilitre d’agent dissoudant la paraffine à l’échantillon de FFPE, prélevé dans un tube de 1,5 millilitre et faites tourner à vitesse maximale pendant 30 secondes jusqu’à ce que la paraffine soit complètement dissoute.

Centrifugez l’échantillon à 16 000 G pendant trois minutes à température ambiante et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette munie d’une petite pointe en évitant la pellete. Ajoutez maintenant un millilitre d’éthanol à 95 % à la pellete et au vortex à vitesse maximale pendant 30 secondes. Centrifugez l’échantillon à 16 000 G pendant trois minutes à température ambiante et jetez le surnageant.

Après réhydratation de l’échantillon, ajoutez 200 microlitres de tampon d’extraction au pellet. Homogénéisez le tissu dans le tampon d’extraction en forniquant avec un signifiant numérique à l’aide d’une pointe micro de trois millimètres. Après homogénéisation, incubez l’échantillon dans un thermomélangeur et ouvrez brièvement le couvercle du tube pour laisser évaporer le formaldéhyde.

Après centrifugation de l’échantillon, transférez le surnageant dans un nouveau tube marqué. Retirez les bandes de gel correspondant au poids moléculaire des protéines histoniques centrales situées entre 10 et 18 kilodaltons à l’aide d’un scalpel. Après avoir coupé les bandes de gel, utilisez le même scalpel pour transférer les morceaux de gel coupés dans un tube de 1,5 millilitre.

Pour éliminer le gel, ajoutez une solution de 50 % d’acétonitrile dans de l’eau double distillée et faites éclore le tube dans un thermomélangeur à 1 400 tours par minute pendant 10 minutes à température ambiante. Déshydratez les morceaux de gel en ajoutant 100 % d’acétonitrile. Mélangez le thermomélangeur à 1 400 tours par minute pendant 10 minutes à température ambiante.

Après avoir jeté le surnageant, séchez les morceaux de gel pendant cinq minutes à température ambiante dans une centrifugeuse sous vide. Ensuite, ajoutez 15 microlitres de solution de proponicanhydride à 7,7 molaires, et 26 microlitres d’un bicarbonate d’ammonium molaire dans chaque tube et incubez. Puis incubez l’échantillon avec 80 microlitres d’une molaire de bicarbonate d’ammonium.

Ensuite, lavez les morceaux de gel trois fois avec de l’eau distillée double et jetez le liquide après chaque incubation. Ensuite, ajoutez 50 % d’acétone nitrile aux morceaux de gel et faites éclore à 1 400 tours par minute pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez 100 % d’acétonitrile pour déshydrater complètement les morceaux de gel.

Incubez dans le thermomélangeur à 1 400 tours par minute pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir écarté le liquide, séchez les morceaux de gel pendant cinq minutes à température ambiante dans une centrifugeuse sous vide. Ajoutez quatre microlitres de solution de trypsine et 20 microlitres de tampon de digestion à chaque tube contenant des morceaux de gel.

Incubez les tubes sur de la glace pendant 10 minutes pour permettre l’absorption de la trypsine dans le gel. Une fois la trypsine complètement absorbée, ajoutez 80 microlitres de tampon de digestion pour recouvrir complètement les morceaux de gel et faites couver les tubes toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un thermomixeur. Pour extraire les peptides digérés, ajoutez 100 microlitres de nitrile 100 % acéto à chaque tube, puis incubez à 1 400 tours par minute pendant 20 minutes à température ambiante dans un thermomélangeur.

Maintenant, récupérez soigneusement le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Après avoir répété l’extraction de nitro aceto avec le gel restant, regroupez les surnatants. Concentrez les peptides regroupés dans une centrifugeuse sous vide jusqu’à ce que le volume soit compris entre un et cinq microlitres.

Ajoutez ensuite deux microlitres d’une molaire de bicarbonate de triéthylammonium, et trois microlitres de solution d’isocyanate de phényle. Incubez l’échantillon à 350 tours par minute pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius dans un thermomélangeur. Pour stopper la dérivitisation, ajoutez huit microlitres d’acide trichloroacétique à 1 % à chaque tube.

Enfin, diluez chaque échantillon en ajoutant 100 microlitres de tampon A et chargez les échantillons dilués sur les pointes de l’étage C18 pour l’élution. L’extraction de histones a été réalisée avec succès à partir d’échantillons frais congelés, OCT congelés et FFPE en utilisant des flux de travail différentiels de traitement spécifiques à chaque type de tissu. Malgré une diminution de l’enrichissement et de la présence de protéines de fond, les histones H3, H2A, H2B et H4 ont été extraites avec succès à partir d’échantillons de FFPE, comme le montrent les bandes dans les FFPE1 et FFPE2 de Lane, correspondant à environ un microgramme de la norme H3.1.

La nanochromatographie liquide et l’analyse en SEP des histones dérivées du FFPE ont montré une séparation réussie des peptides d’histones sur un gradient de 55 minutes avec des pics clairs de temps de rétention observés dans la chromatogramme ionique totale. Les chromatogrammes ioniques extraits ont confirmé la détection et la quantification de formes non modifiées et méthylées de H3 K 4, avec des profils d’élution séparés pour chaque valeur M par Z. Permettant le calcul du pourcentage d’abondance relative pour chaque modification.

L’analyse comparative des modifications des histones entre échantillons normaux et tumoraux a révélé des augmentations significatives de certains types et une diminution d’autres types dans les tissus tumoraux.