Utilisation des outils d’optogénétique LEXY et LINuS et de l’analyse automatisée d’images pour quantifier la dynamique du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes

Notre laboratoire étudie l’interaction entre les pores nucléaires et l’organisation de la chromatine. Nous étudions donc comment les pores nucléaires affectent l’organisation de la chromatine, mais aussi inversement, si l’organisation de la chromatine affecte la fonction des pores nucléaires, en particulier dans le transport nucléocytoplasmique. Le transport nucléocytoplasmique est un processus très rapide, de sorte que l’un des défis consiste à détecter les changements dans la dynamique du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes.

Il n’y a pas beaucoup d’outils disponibles pour surveiller le transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes. En mettant en place une technique semi-automatisée et améliorée, nous espérons faciliter l’utilisation de ces outils. Notre protocole est basé sur l’apprentissage profond.

Il limite les erreurs et réduit considérablement le temps nécessaire à l’analyse. Ce qui prenait auparavant une journée ne prend plus qu’une heure ou deux. Pour commencer, lancez le logiciel FIJI sur le système informatique.

Sélectionnez la phase stable comme image un, la phase d’éclairage comme image deux et la phase de récupération comme image trois. Concaténez les trois images représentant trois phases pour produire une seule image. Enregistrez l’image obtenue et fusionnée pour la segmentation en accédant à Fichier et en sélectionnant Enregistrer au format TIFF.

Ensuite, divisez le canal mCherry en sélectionnant Image, Couleur et Diviser les canaux. Enregistrez ensuite l’image scindée en accédant à Fichier, Enregistrer sous et TIFF. Pour vérifier le blanchiment pendant l’acquisition, sélectionnez séquentiellement Image, Piles et Tracer le profil de l’axe Z.

Cliquez ensuite sur Données, puis sur Copier le premier ensemble de données, et collez-le dans la feuille de calcul fournie sous la cellule de profil de l’axe Z. Dessinez maintenant une région circulaire d’intérêt, se rapprochant de la taille moyenne d’un noyau, en cliquant sur Analyser, puis sur Outils, et en cliquant sur Gestionnaire de retour sur investissement. Ajoutez le retour sur investissement et enregistrez-le en accédant à Plus et en cliquant sur Enregistrer.

Placez le retour sur investissement enregistré dans une région sans cellule pendant le time-lapse. Assurez-vous que l’option Valeur de gris moyenne" est sélectionnée sous Analyser et définir les mesures. Cliquez ensuite sur Plus, Multi Measure.

Cochez la case Mesurer les 50 tranches et un retour sur investissement par tranche et cliquez sur OK pour enregistrer l’intensité. Copiez et collez toutes les valeurs d’intensité mesurées dans la feuille de calcul fournie sous la cellule d’arrière-plan du retour sur investissement. Fermez ensuite l’image avec uniquement le canal mCherry et sélectionnez l’image enregistrée avec les canaux fusionnés.

Ouvrez maintenant le plugin TrackMate en cliquant séquentiellement sur Plugins, Suivi et TrackMate. Vérifiez que les points temporels sont compris entre zéro et 49 et cliquez sur Suivant. Sélectionnez le détecteur StarDist et cliquez sur Suivant.

Choisissez le canal deux, SiR-DNA, pour la segmentation des noyaux et attendez la fin du processus. Laissez les paramètres par défaut dans la fenêtre de seuillage et cliquez sur Suivant. Créez des filtres à l’aide de l’intensité moyenne, canal un, pour exclure les noyaux avec des valeurs de signal extrêmes.

Créez un filtre pour sélectionner les valeurs supérieures au seuil défini et l’autre pour sélectionner les valeurs inférieures au seuil. De même, ajoutez deux filtres de zone pour supprimer les débris ou les cellules mourantes, puis cliquez sur Suivant. Choisissez le traqueur LAP simple et cliquez sur Suivant.

Ensuite, ajustez les paramètres de suivi. Réglez la distance maximale de liaison sur 30 micromètres, la distance maximale de fermeture d’espace sur 15 micromètres et l’écart maximal de fermeture d’espace sur trois. Cliquez ensuite sur Suivant.

Après les calculs, cliquez sur Suivant pour définir des filtres sur les pistes. Pour ne sélectionner que les noyaux qui ont été suivis pendant toute la durée du parcours, choisissez le plus grand nombre de points dans le suivi et cliquez sur Suivant. Cochez ensuite Afficher les noms des points" pour retracer chaque noyau dans des analyses plus approfondies et personnaliser d’autres fonctionnalités d’affichage selon vos préférences.

En bas de la page, cliquez sur Pistes et choisissez Exporter au format CSV" pour enregistrer le tableau de mesure. Fermez le tableau et continuez en cliquant sur Suivant. Cliquez maintenant sur Capturer la superposition en tant qu’action, puis appuyez sur Exécuter, suivi de OK pour générer une image avec des noyaux suivis.

Enregistrez l’image en cliquant séquentiellement sur Fichier, Enregistrer sous, puis en choisissant TIFF. Pour importer le fichier CSV TrackMate dans la feuille de calcul fournie, cliquez sur l’onglet Données. Dans le groupe Obtenir les données de transformation, cliquez sur À partir de texte/CSV, puis sur Importer.

Copiez les colonnes Spot IDB, Track IDC, Frame I et Canal d’intensité moyenne 1M, puis collez-les dans les colonnes A à D de la feuille de calcul fournie. Triez les résultats par ordre alphabétique d’abord par ID de piste, noyau individuel, à partir de la cellule B5, puis par Image, point temporel, à partir de la cellule C5. Ouvrez maintenant GraphPad Prism, créez une nouvelle feuille et copiez-collez la colonne de temps à partir de la feuille de calcul. Collez ensuite les valeurs obtenues en tant qu’intensité nucléaire relative dans le tableau GraphPad Prism.

Pour générer le graphique d’intensité nucléaire relative, accédez à la section Graphique et sélectionnez XY comme famille de graphiques. Choisissez ensuite Points et ligne de connexion avec barres d’erreur" comme type de graphique. Dans les paramètres du tracé, choisissez Moyenne et erreur" et SEM, puis cliquez sur OK. Ensuite, pour obtenir le taux d’exportation, cliquez sur Nouveau tableau de données et entrez les temps en décimales uniquement pour les phases d’écurie et d’éclairage.

Collez les valeurs obtenues en tant qu’intensité nucléaire relative pour ces phases dans le tableau. Dans la section Résultats, cliquez sur Analyse XY suivie de Exponentiel. Choisissez ensuite Régression non linéaire et cliquez sur OK. Sélectionnez Plateau suivi d’une décroissance de phase" comme modèle sous les paramètres.

Choisissez ensuite une constante égale à 2,25 comme X0, une constante égale à un comme Y0 et une constante égale à zéro pour le plateau. Indiquez que K doit être supérieur à zéro et appuyez sur OK. Créez une nouvelle table et collez-transposez les valeurs K obtenues. Dans la section Graphique, sélectionnez Colonne comme famille de graphiques, puis choisissez le tracé du violon comme type de graphique.

Sélectionnez Afficher tous les points" comme tracé et cliquez sur OK. L’exportation nucléaire avec la sonde optogénétique lexy a été visualisée dans l’imagerie de cellules vivantes. Dans les conditions de contrôle avec des cellules traitées au méthanol, l’intensité nucléaire de mCherry a fortement diminué après l’éclairage à la lumière bleue, suivie d’une récupération progressive pendant la phase post-illumination. Le traitement avec l’inhibiteur d’exportation, la leptomycine B, a provoqué un changement dans l’exportation nucléaire, car le signal de la sonde est resté constamment nucléaire à tous les points temporels.

L’analyse quantitative de l’intensité nucléaire relative a montré au fil du temps une lente diminution jusqu’à atteindre un plateau à la fin de la phase d’éclairage. Les concentrations intermédiaires de leptomycine B doivent présenter une légère exportation nucléaire. Les taux d’exportation calculés à partir des données d’intensité ont confirmé un taux d’exportation significativement plus élevé dans les cellules traitées au méthanol, un taux beaucoup plus faible avec 0,5 leptomycine B nanomolaire et presque aucune exportation avec une leptomycine B nanomolaire.