Name: Utilisation des outils d’optogénétique LEXY et LINuS et de l’analyse automatisée d’images pour quantifier la dynamique du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Découvrez l'analyse automatisée du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes grâce aux outils optogénétiques LEXY et LINuS. Cette méthode améliore l'efficacité et la précision des études en biologie cellulaire.

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<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
<li>Kelley, J. B., Paschal, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+quantification+of+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport.</a> Methods. 157, 106-114 (2019).</li>
<li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nat Commun. 4 (2), 1779(2013).</li>
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<li>Niopek, D., Wehler, P., Roensch, J., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+export%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein export.</a> Nat Commun. 7, 10624(2016).</li>
<li>Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminal+helix+modulates+light+activated+conformational+changes+in+AsLOV2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2.</a> J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).</li>
<li>Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+import+in+living+cells+using+light-inducible+nuclear+localization+signals+%28LINuS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS).</a> Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).</li>
<li>Lataster, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+optogenetically+regulated+cell+cycle+inhibitor+protein+p21%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21.</a> Biology. 12 (9), 1194(2023).</li>
<li>Forlani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+slow-cycling+variants+of+the+light-inducible+nuclear+protein+export+system+LEXY+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).</li>
<li>Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+blue+light+transmission+area+in+living+animals+using+light-induced+nuclear+translocation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).</li>
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<li>Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAc+modification+of+nuclear+pore+complexes+accelerates+bidirectional+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport.</a> J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).</li>
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<li>Soderholm, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importazole%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+transport+receptor+importin-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).</li>
<li>Henderson, B. R., Eleftheriou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+activity%2C+sequence+specificity%2C+and+CRM1-dependence+of+different+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals.</a> Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+nuclear+localization+signals+and+mechanisms+of+protein+import+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signaling%22%5BJournal%5D)">Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus.</a> Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), dev175067(2019).</li>
<li>Kögler, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+rapid+and+reversible+optogenetic+perturbation+of+nuclear+proteins+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos.</a> Dev Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiking+of+Cas9+with+nucleus-localized+proteins+impairs+its+controllability+and+leads+to+efficient+genome+editing+of+NLS-free+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9.</a> Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).</li>
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L’importance du transport nucléocytoplasmique (TCN) pour réguler les voies cellulaires clés et maintenir l’homéostasie cellulaire a été bien étudiée au cours des dernières années1. En conséquence, plusieurs outils ont été générés pour étudier la dynamiquedu NCT 2,3,4. Parmi ces outils, les sondes optogénétiques LINuS5 et LEXY6, publiées respectivement en 2014 et 2016, offrent un moyen puissant de surveiller les NCT dans les cellules vivantes. Ces outils, conçus pour suivre soit l’exportation inductible (LEXY), soit l’importation (LINuS) d’un rapporteur fluorescent, sont inductibles par exposition à la lumière bleue et réversibles.
En bref, ces deux petites sondes utilisent les propriétés du domaine LOV2 de la protéine phototropine-1 de la plante Avena sativa7. En l’absence de lumière bleue, l’hélice Jα du domaine LOV2 est photocaged et intégrée dans le noyau de la protéine. Comme l’hélice Jα peut répondre à un stimulus lumineux, l’éclairage par la lumière bleue induit un changement de conformation et le désamarrage ultérieur de l’hélice Jα du domaine LOV2. Les auteurs de LEXY et LINuS ont utilisé cette sensibilité à la lumière pour fusionner soit un signal de localisation nucléaire (NLS), soit un signal d’exportation nucléaire (NES) avec l’hélice Jα, pour LINuS et LEXY, respectivement (Figure 1). L’outil qui en résulte est une sonde qui se déplace dans le noyau (LINuS) ou le cytosol (LEXY) lors de l’éclairage par lumière bleue.
Pour suivre les sondes avec l’imagerie fluorescente, un rapporteur fluorescent mCherry a également été ajouté aux constructions. Enfin, un NES faible (pour LINuS) ou NLS (pour LEXY) a été ajouté au système pour s’assurer que les sondes n’étaient pas dans leur localisation finale avant l’éclairage par lumière bleue, ce qui empêcherait l’observation de la translocation LEXY ou LINuS entre le noyau et le cytosol.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg"> 
Figure 1 : Représentation des sondes LEXY et LINuS. Les deux sondes sont constituées d’une protéine mCherry fusionnée au domaine LOV2 sensible à la lumière. La différence entre les deux outils réside dans la séquence de signalisation cachée par l’hélice Jα : une NES pour LEXY et une NLS pour LINuS. Les deux sondes possèdent également une séquence de signaux faibles pour contrôler leur localisation initiale : un NLS faible pour LEXY et un NES faible pour LINuS. L’activation des systèmes par éclairage à lumière bleue induit donc soit leur exportation pour LEXY, soit leur importation pour LINuS, permettant aux utilisateurs de suivre l’exportation ou l’importation nucléaire. Abréviations : LEXY = système d’exportation nucléaire inductible par la lumière ; LINuS = signal de localisation nucléaire inductible par la lumière ; NLS = signal de localisation nucléaire ; NES = signal d’exportation nucléaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La localisation de la fluorescence mCherry signale la navette des sondes LEXY et LINuS entre les noyaux et le cytosol, et peut donc être suivie dans l’imagerie de cellules vivantes, ce qui permet aux utilisateurs de surveiller le NCT. En plus d’être utilisés comme de simples sondes, LEXY et LINuS peuvent également être modifiés pour contrôler la localisation et étudier les protéines d’intérêt, in vitro 5,6,8,9 ou in vivo10,11.
La méthode de quantification proposée dans les publications LEXY et LINuS permet de montrer l’intensité nucléaire relative des sondes. L’analyse suggérée est effectuée manuellement et repose sur la mesure d’une région d’intérêt (ROI) dans le noyau et le cytosol. Bien que cette méthode donne une bonne représentation du signal de la sonde dans le temps, elle est très longue et fastidieuse, surtout lorsque les expériences et les conditions sont répétées. Il est important de noter que cette méthode manque également de précision, car seule une petite partie du compartiment conçu est représentée.
Nous proposons ici un nouveau protocole pour la quantification des signaux fluorescents LEXY et LINuS. Nous avons mis en place des techniques automatisées, qui facilitent les analyses et apportent une plus grande précision. Cela facilitera le processus pour les nouveaux utilisateurs de ces outils et contribuera à augmenter le débit. Notre protocole de quantification n’utilise qu’une seule interface, le plugin open-source TrackMate12 de FIJI. Notamment, pour améliorer la fiabilité des quantifications, nous avons utilisé un marqueur d’ADN rouge lointain compatible avec l’imagerie en direct pour effectuer la segmentation du noyau entier avec StarDist13, un réseau neuronal convolutif entraîné, combiné au suivi et à la mesure du signal fluorescent de la sonde avec TrackMate12.
Les données obtenues peuvent ensuite être facilement exportées dans le tableur fourni et prêt à l’emploi (tableau supplémentaire S1) pour obtenir l’intensité nucléaire relative de chaque noyau identifié. Ce protocole explique également comment regrouper les valeurs obtenues dans un graphique en ajustant la courbe de parcours temporel obtenue à un modèle monoexponentiel, comme dans Yoo et Mitchison14 et comment calculer le taux de transport pour les différentes conditions testées. Grâce à ce protocole et à la feuille de calcul fournie pour l’analyse, les utilisateurs seront en mesure de quantifier facilement les données d’imagerie de cellules vivantes, même avec des compétences limitées en bioinformatique.

<table><tbody><tr><td>Collagène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Exceller</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. F1141</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel FIJI</td><td>FIDJI</td><td></td><td>ImageJ 2.16.0/1,54p ; Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>Boîtes fluorescentes</td><td>Dutscher</td><td>Réf. FD3510-100</td><td>Alternative : Chambre Attofluor (Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.4.1</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Importazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>Leptomycine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide LEXY</td><td>Addgene</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>Plasmide LINuS</td><td>Addgene</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>Crayonline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sans rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>ADN-SiR</td><td>Spirochrome</td><td>SC007</td><td>Alternative : SPY-DNA650 (Spirochrome #SC501)</td></tr><tr><td>Plugin Stardist 2D</td><td>StarDist</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>Plug-in TrackMate</td><td>TrackMate</td><td></td><td>TrackMate-7.14.0</td></tr></tbody></table>

utilisation des outils d’optogénétique lexy et linus et de l’analyse automatisée d’images pour quantifier la dynamique du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

Le protocole mentionné ci-dessus devrait permettre aux utilisateurs de visualiser la localisation et la translocation de la sonde lors de l’acquisition en imagerie de cellules vivantes. La figure 4 montre un exemple des images attendues acquises pour visualiser l’exportation nucléaire avec LEXY. Une diminution rapide du signal du noyau et un enrichissement du cytosol doivent être observés après quelques cycles d’éclairage à lumière bleue. Une récupération progressive du signal de la sonde peut être visible après l’arrêt des cycles d’éclairage. Pour contrôler le système, la leptomycine B, un inhibiteur d’exportation, atteste qu’un changement d’exportation peut être visualisé avec les analyses, puisqu’elle empêche LEXY d’être exporté lors d’un éclairage en lumière bleue (Figure 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg"> 
Figure 4 : Visualisation du signal de LEXY dans le temps. Capture de points temporels représentatifs des phases d’étable, d’illumination et de récupération, acquis avec l’imagerie de cellules vivantes. La condition du méthanol représente la condition de contrôle. Lors de l’allumage de la lumière bleue pulsatile, en rouge, le signal fluorescent mCherry, rapporteur de la position de LEXY, est transloqué du noyau au cytosol. Après l’arrêt de l’éclairage, le signal est récupéré dans le noyau. Le traitement avec l’inhibiteur d’exportation Leptomycine B à 1 nM ou 0,5 nM montre l’absence ou la diminution de l’exportation de LEXY lorsque l’exportation est bloquée. Barre d’échelle = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
En ce qui concerne les analyses, alors que les valeurs de la courbe d’intensité nucléaire relative pendant la phase stable devraient être autour de 1, après activation de la lumière bleue, elles devraient afficher une lente diminution jusqu’à atteindre un plateau à la fin de la phase d’éclairage (Figure 5A). Si la diminution est trop rapide ou trop lente, les paramètres d’acquisition peuvent être optimisés (voir discussion). Le traitement à la leptomycine B à des concentrations suffisantes peut également confirmer que les analyses et la technique sont suffisamment sensibles pour montrer que l’exportation nucléaire est complètement bloquée, avec des valeurs d’intensité nucléaire relative stables autour de 1 pour l’ensemble de l’expérience. Les concentrations intermédiaires de leptomycine B devraient toutefois présenter une légère exportation nucléaire (figure 5A). Ces observations visuelles devraient être confirmées quantitativement par l’obtention du taux d’exportation (figure 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg"> 
Figure 5 : Intensité nucléaire relative attendue de LEXY et taux de transport. (A) Le graphique représente l’intensité nucléaire relative du signal fluorescent de LEXY au cours du temps, normalisée à l’intensité moyenne de mCherry de la phase stable. L’intensité nucléaire relative de la condition méthanol (contrôle, rouge) diminue de moitié après l’éclairage, contrairement aux cellules traitées avec l’inhibiteur d’exportation Leptomycine B, à une concentration de 0,5 nM (bleu clair) ou 1 nM (bleu foncé). (B) Taux d’exportation des conditions de contrôle et de leptomycine B, obtenu en ajustant la courbe à un modèle monoexponentiel. Les valeurs obtenues lorsque l’exportation est bloquée par la leptomycine B sont significativement inférieures à la condition de contrôle. N = 18 cellules pour le méthanol (rouge), 19 cellules pour la leptomycine B 0,5 nM (bleu clair) et 15 cellules pour la leptomycine B 1 nM (bleu foncé). Les valeurs P ont été calculées par un test t de Welch bilatéral. : P &lt; 1×10−4, **** : P &lt; 1×10−5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire S1 : Tableur avec calculs prédéfinis. Cette feuille de calcul est fournie pour faciliter l’analyse. Les valeurs d’intensité obtenues avec TrackMate peuvent être directement copiées et collées dans la feuille de calcul pour obtenir les valeurs d’intensité nucléaire relatives normalisées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire S2 : Exemple des résultats attendus pour une condition de contrôle de l’analyse de LEXY. La feuille de calcul représente un exemple des valeurs obtenues pour une condition de contrôle de la lignée cellulaire stable de LEXY. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Utilisation des outils d’optogénétique LEXY et LINuS et de l’analyse automatisée d’images pour quantifier la dynamique du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

Notre laboratoire étudie l’interaction entre les pores nucléaires et l’organisation de la chromatine. Nous étudions donc comment les pores nucléaires affectent l’organisation de la chromatine, mais aussi inversement, si l’organisation de la chromatine affecte la fonction des pores nucléaires, en particulier dans le transport nucléocytoplasmique. Le transport nucléocytoplasmique est un processus très rapide, de sorte que l’un des défis consiste à détecter les changements dans la dynamique du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes.Il n’y a pas beaucoup d’outils disponibles pour surveiller le transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes. En mettant en place une technique semi-automatisée et améliorée, nous espérons faciliter l’utilisation de ces outils. Notre protocole est basé sur l’apprentissage profond.Il limite les erreurs et réduit considérablement le temps nécessaire à l’analyse. Ce qui prenait auparavant une journée ne prend plus qu’une heure ou deux. Pour commencer, lancez le logiciel FIJI sur le système informatique.Sélectionnez la phase stable comme image un, la phase d’éclairage comme image deux et la phase de récupération comme image trois. Concaténez les trois images représentant trois phases pour produire une seule image. Enregistrez l’image obtenue et fusionnée pour la segmentation en accédant à Fichier et en sélectionnant Enregistrer au format TIFF.Ensuite, divisez le canal mCherry en sélectionnant Image, Couleur et Diviser les canaux. Enregistrez ensuite l’image scindée en accédant à Fichier, Enregistrer sous et TIFF. Pour vérifier le blanchiment pendant l’acquisition, sélectionnez séquentiellement Image, Piles et Tracer le profil de l’axe Z.Cliquez ensuite sur Données, puis sur Copier le premier ensemble de données, et collez-le dans la feuille de calcul fournie sous la cellule de profil de l’axe Z. Dessinez maintenant une région circulaire d’intérêt, se rapprochant de la taille moyenne d’un noyau, en cliquant sur Analyser, puis sur Outils, et en cliquant sur Gestionnaire de retour sur investissement. Ajoutez le retour sur investissement et enregistrez-le en accédant à Plus et en cliquant sur Enregistrer.Placez le retour sur investissement enregistré dans une région sans cellule pendant le time-lapse. Assurez-vous que l’option Valeur de gris moyenne" est sélectionnée sous Analyser et définir les mesures. Cliquez ensuite sur Plus, Multi Measure.Cochez la case Mesurer les 50 tranches et un retour sur investissement par tranche et cliquez sur OK pour enregistrer l’intensité. Copiez et collez toutes les valeurs d’intensité mesurées dans la feuille de calcul fournie sous la cellule d’arrière-plan du retour sur investissement. Fermez ensuite l’image avec uniquement le canal mCherry et sélectionnez l’image enregistrée avec les canaux fusionnés.Ouvrez maintenant le plugin TrackMate en cliquant séquentiellement sur Plugins, Suivi et TrackMate. Vérifiez que les points temporels sont compris entre zéro et 49 et cliquez sur Suivant. Sélectionnez le détecteur StarDist et cliquez sur Suivant.Choisissez le canal deux, SiR-DNA, pour la segmentation des noyaux et attendez la fin du processus. Laissez les paramètres par défaut dans la fenêtre de seuillage et cliquez sur Suivant. Créez des filtres à l’aide de l’intensité moyenne, canal un, pour exclure les noyaux avec des valeurs de signal extrêmes.Créez un filtre pour sélectionner les valeurs supérieures au seuil défini et l’autre pour sélectionner les valeurs inférieures au seuil. De même, ajoutez deux filtres de zone pour supprimer les débris ou les cellules mourantes, puis cliquez sur Suivant. Choisissez le traqueur LAP simple et cliquez sur Suivant.Ensuite, ajustez les paramètres de suivi. Réglez la distance maximale de liaison sur 30 micromètres, la distance maximale de fermeture d’espace sur 15 micromètres et l’écart maximal de fermeture d’espace sur trois. Cliquez ensuite sur Suivant.Après les calculs, cliquez sur Suivant pour définir des filtres sur les pistes. Pour ne sélectionner que les noyaux qui ont été suivis pendant toute la durée du parcours, choisissez le plus grand nombre de points dans le suivi et cliquez sur Suivant. Cochez ensuite Afficher les noms des points" pour retracer chaque noyau dans des analyses plus approfondies et personnaliser d’autres fonctionnalités d’affichage selon vos préférences.En bas de la page, cliquez sur Pistes et choisissez Exporter au format CSV" pour enregistrer le tableau de mesure. Fermez le tableau et continuez en cliquant sur Suivant. Cliquez maintenant sur Capturer la superposition en tant qu’action, puis appuyez sur Exécuter, suivi de OK pour générer une image avec des noyaux suivis.Enregistrez l’image en cliquant séquentiellement sur Fichier, Enregistrer sous, puis en choisissant TIFF. Pour importer le fichier CSV TrackMate dans la feuille de calcul fournie, cliquez sur l’onglet Données. Dans le groupe Obtenir les données de transformation, cliquez sur À partir de texte/CSV, puis sur Importer.Copiez les colonnes Spot IDB, Track IDC, Frame I et Canal d’intensité moyenne 1M, puis collez-les dans les colonnes A à D de la feuille de calcul fournie. Triez les résultats par ordre alphabétique d’abord par ID de piste, noyau individuel, à partir de la cellule B5, puis par Image, point temporel, à partir de la cellule C5. Ouvrez maintenant GraphPad Prism, créez une nouvelle feuille et copiez-collez la colonne de temps à partir de la feuille de calcul. Collez ensuite les valeurs obtenues en tant qu’intensité nucléaire relative dans le tableau GraphPad Prism.Pour générer le graphique d’intensité nucléaire relative, accédez à la section Graphique et sélectionnez XY comme famille de graphiques. Choisissez ensuite Points et ligne de connexion avec barres d’erreur" comme type de graphique. Dans les paramètres du tracé, choisissez Moyenne et erreur" et SEM, puis cliquez sur OK. Ensuite, pour obtenir le taux d’exportation, cliquez sur Nouveau tableau de données et entrez les temps en décimales uniquement pour les phases d’écurie et d’éclairage.Collez les valeurs obtenues en tant qu’intensité nucléaire relative pour ces phases dans le tableau. Dans la section Résultats, cliquez sur Analyse XY suivie de Exponentiel. Choisissez ensuite Régression non linéaire et cliquez sur OK. Sélectionnez Plateau suivi d’une décroissance de phase" comme modèle sous les paramètres.Choisissez ensuite une constante égale à 2,25 comme X0, une constante égale à un comme Y0 et une constante égale à zéro pour le plateau. Indiquez que K doit être supérieur à zéro et appuyez sur OK. Créez une nouvelle table et collez-transposez les valeurs K obtenues. Dans la section Graphique, sélectionnez Colonne comme famille de graphiques, puis choisissez le tracé du violon comme type de graphique.Sélectionnez Afficher tous les points" comme tracé et cliquez sur OK. L’exportation nucléaire avec la sonde optogénétique lexy a été visualisée dans l’imagerie de cellules vivantes. Dans les conditions de contrôle avec des cellules traitées au méthanol, l’intensité nucléaire de mCherry a fortement diminué après l’éclairage à la lumière bleue, suivie d’une récupération progressive pendant la phase post-illumination. Le traitement avec l’inhibiteur d’exportation, la leptomycine B, a provoqué un changement dans l’exportation nucléaire, car le signal de la sonde est resté constamment nucléaire à tous les points temporels.L’analyse quantitative de l’intensité nucléaire relative a montré au fil du temps une lente diminution jusqu’à atteindre un plateau à la fin de la phase d’éclairage. Les concentrations intermédiaires de leptomycine B doivent présenter une légère exportation nucléaire. Les taux d’exportation calculés à partir des données d’intensité ont confirmé un taux d’exportation significativement plus élevé dans les cellules traitées au méthanol, un taux beaucoup plus faible avec 0,5 leptomycine B nanomolaire et presque aucune exportation avec une leptomycine B nanomolaire.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

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Utilisation des outils d’optogénétique LEXY et LINuS et de l’analyse automatisée d’images pour quantifier la dynamique du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation des outils d’optogénétique LEXY et LINuS et de l’analyse automatisée d’images pour quantifier la dynamique du transport nucléocytoplasmique dans les cellules vivantes

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