Un système de co-culture modifié pour comprendre les interactions entre les cellules de la granulosa-thèque dans l’ovaire bovin

La co-culture de cellules de thèque bovine et de cellules de granulosa sert de base fiable pour analyser la signalisation paracrine et le transport du substrat entre les cellules stéroïdogènes du follicule. Le modèle permet la compartimentation des cellules de thèque et de granulosa de manière similaire à l’environnement in vivo, et l’utilisation d’inserts disponibles dans le commerce permet une culture cellulaire reproductible et standardisée. Nous pourrions créer un environnement physiologique pertinent pour étudier plus en détail l’interaction entre les cellules de la granulosa, comme l’échange de substrat ou la dynamique folliculaire pendant le processus de genèse folliculaire.

Pour commencer, prélevez des ovaires de bovins. Lavez les ovaires de bovins trois fois dans du PBS complété par des antibiotiques pour éliminer le sang et les résidus de la surface. Placez les ovaires dans un gobelet.

Remplissez-le de PBS juste assez pour couvrir les ovaires et jetez la solution. Ajoutez ensuite plus de PBS. Placez un ovaire dans un plat en verre.

À l’aide d’une règle, mesurez et sélectionnez des follicules d’un diamètre compris entre cinq et 11 millimètres pour la dissection. Maintenant, aspirez le liquide folliculaire en perforant un follicule sélectionné avec une aiguille de calibre 18 attachée à une seringue de trois millilitres. Jetez immédiatement le liquide folliculaire.

Transférez les follicules sous un microscope binoculaire. Avec une paire de ciseaux, ouvrez le follicule au site de ponction. À l’aide d’une pince à épiler, saisissez la couche interne de la thèque de la surface interne du follicule ouvert.

Décollez doucement la thèque interne de la paroi folliculaire interne. Transférez la couche de cellules thèques dans une boîte contenant du PBS complété par des antibiotiques pour éliminer les cellules de granulosa restantes. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, grattez doucement les cellules de la granulosa de la surface de la membrane.

Placez la membrane dans un nouveau plat avec du PBS frais pour le lavage. Rincez la membrane en la faisant tourner doucement dans le tampon pour éliminer les cellules résiduelles. Transférez la thèque interne dans une solution de digestion préparée dans un puits d’une plaque à 12 puits.

À l’aide d’un scalpel, coupez-le en morceaux d’un à trois millimètres. Transférez ensuite les morceaux de tissu dans un tube de réaction préparé de 1,5 millilitre. Incuber les tubes dans un incubateur à secousses thermos.

Après 30 minutes d’incubation, faites tourbillonner les tubes pendant trois à cinq secondes avant de les remettre dans l’incubateur. Répétez cette étape de vortex trois fois de plus pendant la période d’incubation restante. Une fois l’incubation terminée, utilisez une pipette pour remettre en suspension les cellules digérées.

Passez la solution à travers une passoire à cellules de 100 micromètres placée sur un tube de 50 millilitres pour éliminer tout tissu non digéré. Préparez la chambre d’inoculation pour la culture des cellules thèques. Placez l’insert revêtu à l’envers dans une plaque plus grande, telle qu’une plaque à 12 puits.

Placez le tube coupé et le tube d’autoclave sur le dessus de l’insert inversé, en vous assurant qu’il est bien ajusté pour éviter les fuites de fluide. Décongelez rapidement les cellules thèques cryo-conservées dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Transférez immédiatement la suspension cellulaire décongelée dans un milieu préchauffé.

Centrifugez la suspension de cellules thèques à 500 G pendant trois minutes à environ 20 degrés Celsius. Jetez le surnageant. Remettez ensuite la pastille en suspension dans un milieu essentiel alpha minimum supplémenté.

Semez 200 microlitres de suspension cellulaire dans la chambre d’inoculation. Pour fermer la boîte de culture cellulaire, augmentez la distance entre la plaque et le couvercle à l’aide de bouchons coupés et autoclavés à partir de tubes de réaction de 1,5 millilitre placés dans chaque coin de la boîte. Fermez soigneusement la plaque de puits sans déplacer les inserts.

Transférez ensuite délicatement la plaque fermée dans un incubateur humidifié. Remplissez une plaque de 24 puits avec 500 microlitres de média dans chaque puits souhaité. Retirez délicatement la chambre de l’insert à l’aide d’une pince à épiler.

Placez l’insert contenant les cellules de thèque attachées dans la plaque à 24 puits, la thèque vers le bas. Pour l’ensemencement des cellules de granulosa, pipetez 250 microlitres de suspension cellulaire à l’intérieur de chaque insert. Incuber la co-culture à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant six jours.

Effectuez un échange de média toutes les 48 heures après l’ensemencement des cellules de la granulosa en remplaçant les 2/3 du volume du média. Les cellules thèques exprimaient exclusivement CYP17A1, tandis que les cellules de la granulosa exprimaient principalement CYP19A1. Après trois jours de culture, les cellules thèques présentaient une morphologie aplatie et allongée sur la membrane recouverte de collagène, indiquant une fixation réussie.

Lorsqu’elles ont été cultivées seules pendant neuf jours, les cellules thèques ont proliféré et ont atteint la confluence le neuvième jour. Les cellules de la granulosa cultivées seules pendant six jours ont développé une morphologie semblable à celle des fibroblastes et formé des amas caractéristiques du comportement in vitro. Dans le système de coculture, aucune différence morphologique n’a été observée dans l’un ou l’autre type de cellule par rapport à leurs monocultures respectives.

Les niveaux d’œstradiol étaient similaires entre les monocultures et les co-cultures de cellules de granulosa. Alors que les monocultures de cellules thèques n’ont produit que des quantités négligeables. CYP17A1 expression est restée confinée aux cellules thèques dans des conditions de monoculture et de co-culture.

CYP19A1 expression est restée confinée aux cellules de la granulosa dans des conditions de monoculture et de co-culture.