Microscopie à expansion : imagerie fluorescente haute résolution avec un microscope conventionnel

Nous sommes des biologistes cellulaires qui étudient le rôle des microtubules et leur fonction associée dans différents organismes modèles. Nous visons à étudier leur rôle dans l’organisation cellulaire, la morphogenèse, la ciliogenèse et la division. Au cours des cinq dernières années, nous avons contribué à la compréhension de la composition moléculaire circulaire, notamment grâce à l’utilisation de la microscopie d’expansion.

Et par là, nous révélons la caractéristique clé de leur assemblage et de leur fonction. En combinant la microscopie d’expansion et la cryofixation, notre protocole permet l’imagerie haute résolution tout en préservant la structure quasi native de l’élément cellulaire, ce qui surmonte la principale limitation de la microscopie à super-résolution. La microscopie d’expansion est une technique à faible coût et facile à mettre en œuvre qui donne accès à tout le laboratoire à une super résolution.

Pour commencer, utilisez une seringue et une aiguille pour remplir chaque tube de cinq millilitres avec un millilitre d’acétone sèche supplémentaire sous une hotte chimique. Placez les tubes à la verticale dans un support métallique et placez-les dans de l’azote liquide pour congélation. Remplissez la moitié d’une boîte en polystyrène à parois de 30 par 30 centimètres d’épaisseur avec de la glace sèche, puis remplissez le dewar de type Vitrobot avec de l’azote liquide jusqu’à ce que l’évaporation cesse.

Maintenant, retirez l’araignée de l’appareil de plongée et remplissez la chambre métallique de plongée avec de l’éthane liquide. Attendez 10 minutes pour permettre à l’éthane d’atteindre l’équilibre. Ensuite, prenez une housse de 12 mm avec une pince fine et tamponnez-la sur un papier de soie pour absorber l’excès de médium de la gaine.

Maintenez la gaine de couverture à mi-chemin, à l’aide d’une pince équipée d’un anneau de serrage compatible avec la ventouse cryogénique. Placez la pince tenant la housse dans le porte-piston cryogénique, puis utilisez du papier Whatman pour enlever le reste du support. Activez le cryo-plunger pour plonger la couche de couverture dans la solution d’éthane contenue dans la chambre métallique.

Ensuite, transférez rapidement la gaine de couverture dans le tube contenant de l’acétone congelée. Incubez les tubes contenant les couvertures dans de la glace sèche à un angle d’environ 45 degrés. Placez le récipient fermé sur un vibrateur orbital réglé à 50 à 100 tr/min, et agitez toute la nuit à quatre degrés Celsius pour laisser la température monter progressivement.

Ensuite, retirez la majeure partie de la glace sèche de la boîte. Continuez l’agitation sur le vibrateur orbital pendant 45 minutes supplémentaires pour laisser la température passer de moins 80 degrés Celsius à moins 20 degrés Celsius. Ouvrez et fermez brièvement chaque tube pour libérer la pression interne.

Ensuite, transférez chaque goulot de couverture dans une plaque à 12 puits ou un récipient approprié pré-rempli d’une solution pré-refroidie à 100 % d’éthanol. Après une incubation de cinq minutes, réhydratez les couches de couverture à travers une série éthanol graduée. Après avoir transféré les couvertures dans le PBS, placez-les au microscope.

Utilisez une pince fine pour gratter doucement la surface et orientez toutes les enveloppes avec le côté droit vers le haut. Placez les barbons dans une plaque à quatre puits remplie de 0,5 à un millilitre de solution à 2 % d’acrylamide et 1,4 % de formaldéhyde dans PBS. Puis incubez les couches de couverture dans cette solution à 37 degrés Celsius sans agitation.

Ensuite, décongelez 10 % d’APS et la solution de gélification sur de la glace pendant 10 minutes avant la gélification. Préparez une chambre humide à l’aide d’une fine couche de papier humide et de Parafilm. Ensuite, conservez-le à quatre degrés Celsius.

Après 10 minutes, placez la chambre humide sur un bloc froid pour l’utiliser pendant la gélification. Maintenant, retirez les couvertures de la solution d’ancrage protéique et évacuez l’excès de liquide à l’aide de papier de soie lors de deux passages consécutifs. Ajoutez l’APS à la solution de gélification pour atteindre une concentration finale de 0,5 % et un vortex pendant deux à trois secondes.

Ensuite, pipettez deux gouttes de 35 microlitres sur le Parafilm dans la chambre humide et placez délicatement chaque couche de couverture sur une goutte, les cellules faisant face vers le bas dans la solution de gélification. Transférez la chambre humide dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Pour la dénaturation, utilisez un outil de biopsie d’un diamètre de 0,4 centimètre pour extraire les morceaux de gel, puis placez-les dans une plaque à six puits remplie d’un millilitre de tampon de dénaturation.

Agitez la plaque pendant 10 à 15 minutes, jusqu’à ce que les gels se détachent des caches de couverture, puis transférez les morceaux de gel détachés dans des tubes microcentrifugeuses de 1,5 millilitre remplis d’un tampon de dénaturation frais. Faites couver les gels pendant 90 minutes à 95 degrés Celsius. Après l’incubation, transférez les gels dans de l’eau distillée double pendant 10 minutes pour les laver.

Mesurez le diamètre des gels à l’aide de papier millimétrique pour évaluer le facteur d’expansion du gel. Recouvrez les couches de protection avec environ 200 microlitres de solution de polylysine. Incubez les couches de couverture pendant une heure à température ambiante, puis lavez-les trois fois avec de l’eau double distillée pour éliminer tout excès de polylysine.

Après avoir séché les gaines-couvertes, conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à leur utilisation. Placez le gel correctement orienté, avec les cellules vers le haut, sur un papier sans peluches et laissez-les sécher pour éliminer l’excès d’eau. Enfin, montez les gels séchés avec les cellules orientées vers le bas sur des caches recouvertes de poly-D-Lysine.

La cryofixation a préservé le réseau mitochondrial dans les cellules RPE1 plus efficacement que la fixation de PFA, comme le montre la coloration ester NHS et ATP5A, et a permis la résolution des cristes mitochondriales, qui n’étaient pas visibles avec la fixation de PFA. La cryofixation a permis une meilleure préservation des microtubules dynamiques, y compris les microtubules cytoplasmiques et astraux dans les cellules RPE1 mitotiques, comparé à la fixation par PFA. La cryofixation de Trypanosoma brucei a mieux préservé l’architecture de la mitochondrie et la structure cellulaire générale comparée à la fixation PFA, telle que visualisée avec la coloration par TDH et esters NHS.

De plus, la cryofixation a mieux préservé le réticulum endoplasmique que la fixation de PFA basée sur la coloration BIP. Des fissures ont été observées dans les cellules RPE1 cryofixées, mais celles-ci n’ont pas perturbé la structure ultra des organites, tels que les mitochondries ou les microtubules. Une mauvaise cryofixation était indiquée par des structures en forme de bulles et des microtubules ondulés, accompagnés d’une perte d’intégrité des organites membraneux.

La qualité de l’expansion dépendait de la clarté des solutions d’acrylate de sodium, les solutions utilisables apparaissant incolores ou légèrement jaunes et translucides, tandis que celles inutilisables paraissaient troubles et oranges.