Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l'imagerie optique

Bienvenue dans le laboratoire du Dr. Hiku Alge Blink. Nous tenons à remercier l'Institut de Californie pour la médecine régénérative pour le financement de ce projet. Le marquage des cellules souches avec un agent de contraste fluorescent permet le suivi in vivo des cellules souches transplantées in vivo.

L'imagerie optique ultérieure des cellules souches marquées permet des études longitudinales au cours desquelles on peut suivre de manière non invasive la migration des cellules in vivo. Cette vidéo vous montrera comment marquer à la fois les cellules souches embryonnaires humaines et les cellules souches mésenchymateuses humaines à l'aide de colorants fluorescents. Bonjour, je suis Sophie Boddington, du Groupe de recherche sur les agents de contraste du Département de radiologie de l'Université de Californie à San Francisco.

Aujourd'hui, je souhaite vous présenter deux techniques différentes pour marquer des cellules souches à l'aide d'agents de contraste fluorescents. L'une permet de marquer des cellules souches mésenchymateuses avec le colorant fluorescent DID, et l'autre des cellules souches embryonnaires humaines avec l'endign ingra. Permettez-moi donc de commencer par vous montrer notre technique de marquage des cellules souches mésenchymateuses humaines au moyen du DID.

Pour commencer la procédure d'étiquetage des cellules souches mésenchymateuses, nous devons les trypsiner et les compter afin d'obtenir une suspension contenant un nombre défini de cellules. Étant donné qu'il s'agit d'une technique standard de culture tissulaire, nous n'en présenterons pas les détails. Nous souhaitons suspendre les cellules que nous allons étiqueter à une densité de 1 million de cellules par millilitre dans un milieu de culture sans sérum.

Tout d'abord, nous ajoutons cinq microlitres d'agent de contraste DID par millilitre de suspension cellulaire. Ensuite, nous mélangeons la solution par pipetage doux, puis les cellules sont incubées avec la solution de marquage dans une plaque à six puits à faible adhérence à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois l'incubation simple terminée, nous devons maintenant transférer la solution cellulaire dans un tube de centrifugation de 15 millilitres.

Nous centrifugeons à 400 RCF pendant cinq minutes. Ensuite, nous aspirons le milieu de marquage en veillant à ne pas perturber le culot. Nous lavons maintenant les cellules avec du PBS.

Nous aspirons et rejetons les cellules plusieurs fois, en veillant à bien dissocier l'agrégat cellulaire. Les deux dernières étapes sont répétées deux fois supplémentaires, pour un total de trois étapes de lavage.

Nous comptons maintenant les cellules et effectuons un test au trypan bleu afin de déterminer la viabilité cellulaire. Une fois la viabilité cellulaire déterminée, vos cellules sont prêtes à être observées au moyen de l'imagerie optique. Pour commencer la procédure d'étiquetage des cellules souches embryonnaires humaines, nous devons tout d'abord préparer l'agent de contraste appelé vert indocyanine.

Ensuite, nous le mélangeons avec l'agent de transfection connu sous le nom de protamine. Pour commencer, nous prélevons un milligramme de poudre d'indocyanine verte et la dissolvons dans cent microlitres de DMSO. Nous ajoutons 400 microlitres de DMEM contenant 10 % FCS au mélange et agitons soigneusement, ce qui nous donne une concentration finale de deux milligrammes par millilitre d'indocyanine verte.

Ensuite, nous ajoutons l'agent de transfection, la protamine, qui agit comme un vecteur pour l'agent de contraste, permettant son entrée plus efficace dans la cellule. Nous mélangeons maintenant cinq microlitres de sulfate de protamine à 10 milligrammes par millilitre avec 300 microlitres de ICG et 300 microlitres de DMEM sans sérum. Nous agitons ensuite la nouvelle solution de transfection pendant cinq minutes afin de permettre la formation de complexes.

Ensuite, nous aspirons l'ancien milieu et ajoutons 10 millilitres de DMEM PRÉCHAUFFÉ aux cellules. Nous ajoutons la solution de protamine ICG préparée précédemment aux cellules et commençons l'incubation d'une heure en plaçant la boîte dans l'incubateur à 37 degrés Celsius. Une fois l'incubation terminée, nous retirons la boîte de l'incubateur, aspirons la solution de marquage et lavons les cellules en rinçant la boîte avec cinq millilitres de PBS.

Les cellules sont ensuite traitées à la trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. L'agitation de la boîte facilite le détachement des cellules en suspension. Nous pipetons maintenant doucement plusieurs fois afin de dissocier les colonies restantes.

Nous neutralisons la trypsine en ajoutant une quantité égale de DMEM contenant 10 % de SFC dans la boîte. Ensuite, nous transférons la solution cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifugeons la solution à 400 RCF pendant cinq minutes. Nous resuspendons les cellules dans un milieu complet.

Nous pouvons maintenant éliminer les agrégats ou complexes résiduels en faisant passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 40 micromètres. Une fois que nous avons une solution cellulaire sans agrégats, nous aspirons l'ancien milieu et resuspendons le culot dans un milieu complet pour cellules souches embryonnaires humaines préchauffé. À ce stade, nous devons séparer les cellules nourricières murines des cellules souches embryonnaires humaines.

Cela est fait afin de s'assurer que nous n'imaginons ultérieurement que les cellules souches. Pour cela, nous transférons la solution cellulaire dans une boîte de Pétri de 10 centimètres revêtue de gélatine. Nous plaçons la boîte dans l'incubateur à 37 degrés et laissons reposer pendant 45 minutes.

Pendant ce temps, veillez à ne pas perturber la boîte. Les cellules nourricières vont maintenant adhérer à la boîte, contrairement aux cellules souches. Nous transférons la solution hors de la boîte de Pétri et obtenons ainsi une solution étiquetée de cellules uniques de cellules souches embryonnaires humaines.

Nous pouvons maintenant compter les cellules et effectuer un test au bleu sur celles-ci. Après avoir confirmé la viabilité, nos cellules sont prêtes à être observées en imagerie. La diapositive montre un exemple de la manière dont les cellules souches peuvent être visualisées in vivo chez des souris après avoir été marquées avec un agent de contraste fluorescent et administrées par une injection IP.

Des analyses d'imagerie optique en série ont montré une accumulation initiale des cellules dans les poumons, suivie d'une redistribution dans le foie, la moelle osseuse des extrémités et la glande thyroïde. L'étiquette fluorescente peut également être utilisée pour représenter directement les cellules souches transplantées dans des échantillons d'histopathologie au moyen de la microscopie fluorescente. Nous venons de vous montrer comment marquer les cellules souches avec des agents de contraste fluorescents lors de l'étiquetage cellulaire.

Il est important de se rappeler de normaliser chaque étape. Nous faisons cela afin d'assurer une efficacité de marquage et une viabilité cellulaire constantes, de sorte que les résultats provenant de différentes expériences puissent être comparés. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre marquage cellulaire.