Microscopie de localisation par ultrasons pour la cartographie à super-résolution de la microvascularisation cérébrale des rongeurs

Nos recherches visent à caractériser l’architecture microvasculaire et le flux cérébraux, tout en affinant les méthodes d’échographie à super-résolution. Les développements récents ont optimisé le suivi des microbulles et renforcé les pipelines de traitement pour créer des protocoles plus stables pour la cartographie vasculaire à super-résolution avec ULM. Pour commencer, placez une souris anesthésiée sur un cadre stéréotaxique avec un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius.

En utilisant une pression ferme mais non nocive, pincez l’orteil ou la queue pour vérifier l’absence de réflexes et confirmer une profondeur d’anesthésie adéquate. Appliquez une pommade oculaire sur les deux yeux pour prévenir les ulcères et la formation de cataractes pendant la procédure. Maintenant, rasez la tête de la souris avec une tondeuse.

Appliquez une crème dépilatoire. Laissez reposer d’une à 1,5 minute maximum, puis rincez soigneusement à l’eau tiède, et séchez avec de la gaze. Ensuite, appliquez du gel centrifugé à ultrasons sur la tête pour assurer un couplage acoustique.

Pour la cathétérisation des veines caudales, utilisez un ensemble d’infusion ailé de 27 gauges d’un demi-pouce relié à une aiguille de 18 gauge d’un demi-pouce avec huit pouces de tube. Raccourcez le tube, si possible, pour minimiser le volume mort. Tournez doucement la queue de l’animal de 90 degrés pour exposer les veines latérales de la queue.

Ensuite, fixez la queue avec du ruban adhésif pour maintenir la stabilité et empêcher les mouvements lors du cathétérisme. Maintenant, identifiez la veine de la queue. Pour améliorer la visibilité des veines, réchauffez la queue avec de l’eau tiède afin de favoriser la vasodilatation.

À l’aide d’un doigt, appliquez une pression douce à la base de la queue, puis faites-la glisser vers le site d’injection à l’opposé du flux sanguin. Insérez l’aiguille parallèlement à la veine avec le biseau orienté vers le haut. Observez le tube pour détecter des flashbacks sanguins afin de confirmer le bon placement de l’aiguille.

Sur le système d’imagerie, lancez le logiciel d’acquisition d’échographies fonctionnelles et créez une nouvelle session d’expérience. Ajustez la position de la sonde à ultrasons. Maintenant, lance l’acquisition de la vue en direct dans le logiciel, et ajuste la sonde en temps réel à l’aide d’imagerie Power Doppler pour centrer le cerveau sur l’écran.

Optimisez les paramètres d’imagerie, tels que le contraste et la compression, pour améliorer la qualité de visualisation. Ensuite, ouvrez le menu Angio 3D dans le logiciel d’acquisition. Ajustez les paramètres de balayage pour couvrir complètement le cerveau, puis commencez l’acquisition du scan.

Gardez le logiciel d’acquisition ouvert, et une fois l’Angio 3D terminé, lancez le logiciel IcoStudio pour l’analyse et la visualisation. Chargez le scan Angio 3D pour la relecture. Naviguez jusqu’au panneau d’enregistrement du cerveau et enregistrez le scan 3D Angio en utilisant soit le mode entièrement automatique, soit manuel.

Enregistrez l’enregistrement complété sous forme de fichier BPS. Maintenant, ouvrez le menu de navigation Cerveau et faites défiler jusqu’au panneau gestionnaire d’Atlas. Utilisez le navigateur d’arbre parent et enfant pour parcourir l’atlas cérébral de la souris Allen, et sélectionnez les régions anatomiques souhaitées pour la superposition dans le panneau à trois vues.

Choisissez un plan d’imagerie qui chevauche les régions d’intérêt sélectionnées. Dans la vue coronale, placez manuellement deux marqueurs pour définir la tranche d’imagerie souhaitée. Ensuite, cliquez sur BPS Positioning pour extraire les coordonnées motorisées du plan d’imagerie sélectionné.

Consultez l’aperçu de l’image du scan 3D Angio, puis cliquez sur Copier les coordonnées BPS. Passez au logiciel IcoScan et ouvrez le panneau de sonde Move. Cliquez sur Neuronavigation, collez les valeurs copiées, et laissez le système aligner automatiquement la sonde avec le plan d’imagerie sélectionné.

Ensuite, commencez l’imagerie en direct pour confirmer que le plan d’imagerie actuel est aligné avec le plan précédemment sélectionné. À l’aide d’une seringue stérile, injectez cinq millilitres de solution de chlorure de sodium à 0,9 % dans le flacon microbulle d’agent de contraste à ultrasons à travers le septum. Agitez vigoureusement le flacon pendant 20 secondes pour resuspendre les microbulles et assurer une dispersion uniforme.

Prédéfinissez les paramètres d’enregistrement, y compris la séquence d’échographie, la fréquence d’images par seconde et la durée totale de l’enregistrement. Ensuite, prélever le volume désiré de microbulles pour injection et commencer l’acquisition. Une fois l’acquisition commencée, injectez 100 microlitres pour les souris en utilisant la dilution appropriée.

Confirmez l’amélioration du contraste sur le panneau de visualisation en direct. Éliminez immédiatement les microbulles restantes dans le volume mort en injectant du liquide physiologique dans le cathéter. Attendez que l’acquisition soit terminée et enregistrez les données enregistrées.

Ouvrez le logiciel Icolab et cliquez sur l’onglet microscopie de localisation par ultrasons. Ensuite, cliquez sur Calculer les cartes ULM pour commencer le flux de traitement. Sélectionnez le dossier source contenant les données acquises précédemment.

Ensuite, sélectionnez le fichier de scan spécifique à traiter et ajustez les limites du temps de traitement selon les besoins. Cliquez sur Suivant pour passer à l’étape de signalement. Définissez le chemin du dossier de sortie pour sauvegarder les fichiers traités, et configurez les paramètres de visualisation des images du rapport.

Cliquez maintenant sur Exécuter pour commencer le traitement des données. Une fois terminé, un fichier TRK sera créé contenant des coordonnées micro-bulles localisées, ainsi que des fichiers TIFF représentant la densité, la vitesse et l’amplitude rétrodiffusée. Chargez le fichier TRK dans IcoStudio pour commencer à explorer les données traitées.

Ensuite, utilisez le panneau côté droit d’IcoStudio pour ajuster les paramètres de visualisation tels que le contraste, la compression et la carte des couleurs afin d’améliorer la représentation des données. Pour définir le temps d’intégration, ajustez le double curseur situé en bas de la vue principale afin de définir les images de début et de fin de l’analyse. L’onglet densité montre la répartition des occurrences de microbulles.

Choisissez entre densité absolue et densité directionnelle. Ensuite, cliquez sur l’onglet Vélocité pour afficher la vitesse des microbulles en millimètres par seconde en utilisant les modes absolu, directionnel, axial et latéral. Ajustez les seuils de contraste, de compression et de vélocité pour améliorer la clarté de l’image.

Explorez ensuite l’onglet Amplitude rétrodiffusée pour observer la réflectivité des microbulles, qui renforce le contraste et révèle les structures microvasculaires ainsi que le mouvement hors plan. Exportez les images sous forme de PNG haute résolution, ou générez des fichiers TIFF pour une analyse quantitative avec une taille de pixel personnalisable. Les cartes de densité de microbulles d’une tranche cérébrale coronale de rat acquise avec ULM ont résolu à la fois de grands vaisseaux et de fines structures capillaires, révélant une topologie vasculaire détaillée, incluant les bifurcations et les motifs de ramification.

La carte de vitesse de la même tranche cérébrale montrait un flux axial clair, le flux ascendant représentant le drainage veineux, et le flux descendant correspondant à la perfusion artérielle, cohérent avec l’architecture vasculaire corticale connue. La carte d’amplitude rétrodiffusée fournissait un contraste dépendant de la profondeur et mettait en évidence les vaisseaux en fonction de leur position élévationnelle, utile pour segmenter des vaisseaux hors plan ou à faible amplitude. Les cartes de densité vasculaire acquises d’un écart faible chez la même souris ont montré un fort chevauchement spatial, confirmant la reproductibilité du ciblage du plan coronal à l’aide du système de positionnement cérébral.

L’analyse quantitative du cortex somatosensoriel gauche sur les sessions a montré des distributions similaires du rayon du vaisseau, de la vitesse et du débit, démontrant la reproductibilité des mesures. Une reproductibilité similaire a été observée dans la région du thalamus gauche, avec des valeurs constantes pour le rayon du vaisseau, la vitesse et le débit entre les séances de la semaine un et la semaine deux. Ce travail établit que la microscopie de localisation par ultrasons peut produire de manière fiable des cartes super-résolutions de la structure et du flux microvasculaire in vivo.

Ce protocole répond au besoin d’une procédure standardisée permettant des acquisitions robustes d’ULM chez des rongeurs vivants à l’aide d’un système d’échographie fonctionnelle dédié.