Technique d’injection sous-rétinienne transsclérale mini-invasive optimisée chez la souris

Les injections sous-rétiniennes sont un outil important pour les investigations précliniques des thérapies pour les maladies rétiniennes héréditaires. Dans cette vidéo, nous présentons une technique d’injection sous-rétinienne optimisée et peu invasive chez la souris. Les injections sous-rétiniennes transsclérales sont un excellent moyen d’administrer du matériel aux photorécepteurs et à l’EPR.

Cependant, cette technique est techniquement difficile et nécessite de développer un protocole optimisé pour augmenter sa reproductibilité et son accessibilité. Nos améliorations comprennent le développement d’un spéculum pour les paupières de souris, l’administration préopératoire d’atropine, la création d’une sclérotomie ponctuelle à l’aide d’un couteau en diamant et l’optimisation de la taille de l’aiguille et de l’approche d’injection. Nous espérons que la cohérence, la reproductibilité, l’excellente couverture de transduction et les dommages chirurgicaux minimes de notre méthode amélioreront l’accessibilité des injections sous-rétiniennes pour la communauté scientifique.

Nos optimisations facilitent et accélèrent la réalisation d’injections sous-rétiniennes chez la souris, réduisent la variabilité expérimentale et améliorent les taux de réussite des injections. Cette technique facilitera la recherche translationnelle préclinique future sur la rétine. Pour commencer, administrez un milligramme par kilogramme d’atropine intrapéritonéale dans un volume total de 50 microlitres 30 minutes avant d’effectuer l’injection sous-rétinienne.

Chargez une micro-aiguille en verre avec le volume souhaité de la solution d’injection. Fixez l’aiguille au micro-injecteur et réglez la pression de compensation sur cinq hectopascals pour contrer l’action capillaire. Placez la souris anesthésiée sous un stéréomicroscope à dissection.

Appliquez une goutte de 0,5 % de proparacaïne sur l’œil pour obtenir une anesthésie topique. Appliquer une goutte d’un mélange contenant 0,2 % de cyclopentolate et 1 % de phényléphrine sur l’œil pour dilater la pupille pour l’imagerie postopératoire de la bulle sous-rétinienne et pour réduire les saignements peropératoires. À l’aide d’un spéculum miniature personnalisé, exposez le fornix supérieur et immobilisez le spéculum pour permettre une rétraction de la paupière supérieure mains libres.

À l’aide de ciseaux Vannas inclinés, faites une paire d’incisions limbiques d’environ un millimètre en arrière du limbe dans la conjonctive supérieure et la capsule de Tenon pour exposer la sclère supérieure. Retirez soigneusement tous les restes de la capsule de Tenon sur le site d’injection. Saisissez maintenant le bord antérieur de la péritomie et de la ténotomie conjonctivales à l’aide d’une pince dentée verrouillable.

Ensuite, inféroduduisez doucement le globe pour exposer la sclère supérieure. Appliquez immédiatement une goutte de solution saline tamponnée équilibrée sur l’œil pour garder la sclérotique nue hydratée et obtenir un plus grand grossissement optique. À l’aide d’un couteau en diamant, faites une sclérotomie précise vers 12 heures et à un à deux millimètres du limbe.

Positionner la lame tangentiellement à la sclérotique pour s’assurer que la sclérotomie est petite et peu profonde. À l’aide d’une éponge chirurgicale, on retire délicatement toute solution saline tamponnée équilibrée de la surface de l’œil. Maintenez le biseau de l’aiguille vers le bas à un angle peu profond par rapport à la sclérotique et insérez lentement l’extrémité dans la sclérotomie, en avançant de seulement 0,5 à un millimètre pour accéder à l’espace sous-rétinien sans pénétrer dans la rétine.

Tout en maintenant l’aiguille stable, initier l’injection à 500 hectopascals à l’aide de la pédale et maintenir une pression continue pendant 15 secondes. Retirer l’aiguille et observer un reflux partiel de la solution injectée à travers le site de la sclérotomie, indiquant une administration réussie car l’espace sous-rétinien ne peut pas accueillir le volume total de la solution injectée. Retirez délicatement la pince de verrouillage et le spéculum de la paupière sans appliquer de pression sur le globe pour éviter un reflux supplémentaire.

Immédiatement après l’injection, appliquez une quantité généreuse de pommade oculaire lubrifiante sur l’œil pour aider à la visualisation des bulles sous-rétiniennes. Une bulle sous-rétinienne était clairement visible à l’OCT immédiatement après l’injection transsclérale, confirmant la réussite de l’accouchement. Pour évaluer l’épithélium pigmentaire rétinien, ou EPR, une injection ciblée de dystrophine 1-GFP AAV-8 a été injectée, ce qui a entraîné une fluorescence verte généralisée à travers la couche d’épithélium, indiquant une transduction efficace et large de l’EPR à l’aide de l’approche transsclérale.

La rhodopsine GFP de l’AAV-8 a conduit à un fort signal fluorescent vert dans les photorécepteurs des bâtonnets, visible à la fois en coupes efficaces et en vues du fond d’œil, indiquant un ciblage et une expression réussis dans les cellules photoréceptrices. AAV8-CAG-mCherry a produit une large fluorescence rouge à travers les couches rétiniennes, démontrant la capacité de cette technique à soutenir l’expression généralisée des transgènes au-delà de types cellulaires spécifiques. Le western blot des lysats rétiniens a également montré une forte expression de protéine fluorescente verte, les niveaux les plus élevés correspondant au centre de la bulle d’injection, validant la transduction des photorécepteurs avec la rhodopsine GFP AAV8.

L’optimisation du titre AAV à l’aide de l’analyse par immunofluorescence des coupes rétiniennes permet de sélectionner le titre viral qui réalise la transduction d’environ 90 % des cellules cibles. Par exemple, dans ce cas, une dilution de un à 10 d’un stock viral de rhodopsine GFP AAV8 a produit l’expression du transgène dans presque tous les photorécepteurs. En revanche, une dilution de un à 100 a entraîné un taux de transduction insuffisant.

L’électrorétinogramme a montré que les injections transsclérales préservaient la fonction rétinienne normale, tandis que les injections transrétiniennes entraînaient une réduction significative des réponses des ondes A et B, indiquant des lésions rétiniennes.