Microscopie multi-harmonique à autofluorescence simultanée sans marquage

La microscopie multi-harmonique à autofluorescence simultanée sans marquage, ou microscopie SLAM, capture des informations uniques dans les échantillons biologiques en mesurant les interactions non linéaires avec la lumière. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette technique pour étudier la vie et les maladies à l’échelle microscopique. Nous observons une évolution vers l’imagerie multimodale sans marquage, offrant des informations plus riches sur les structures et la dynamique cellulaires et tissulaires, tout en évitant la toxicité et en permettant des contrastes et des corrélations complémentaires entre les modalités.

Les microscopes non linéaires sans marquage à la pointe de la technologie acquièrent un signal à la fois, ce qui risque d’entraîner un désalignement, des dommages photographiques et de nombreux processus simultanés. Le SLAM surmonte ces problèmes en permettant un contraste multimodal strictement coenregistré, garantissant des données spatiales et temporelles fiables. Cette technique permet l’excitation et la détection simultanées de quatre canaux dans un microscope multiphotonique.

Utilisation de la fibre de cristaux photoniques pour élargir les impulsions pour SHG, THG et la fluorescence à deux et trois photons. SLAM capture des informations de signalisation cellulaire métabolique structurelle et dynamique multiplexées sans artefacts d’alignement ni marqueurs exogènes, ce qui permet une analyse quantitative standardisée des tissus. Ses applications couvrent la biologie fondamentale, la recherche translationnelle et la découverte de biomarqueurs en oncologie, en neurodégénérescence et en régénération tissulaire.

Pour commencer, utilisez un spectromètre ou un analyseur de spectre optique pour mesurer le laser après le miroir parabolique et vérifier la génération de supercontinuum de la fibre de cristal photonique. Faites pivoter la plaque à mi-chemin après le séparateur de faisceau polarisant pour optimiser la largeur du supercontinuum. Allumez l’autocorrélateur de microscopie.

Dans le logiciel, réglez le détecteur sur le détecteur interne et ajustez la plage de balayage à 5 picosecondes pour capturer toute la largeur de l’autocorrélation d’impulsions. Débloquez le laser et alignez l’autocorrélateur sur le faisceau sortant du façonneur d’impulsions jusqu’à ce qu’un signal apparaisse. Assurez-vous que le volet 2 est fermé.

Appliquez ensuite le support d’immersion approprié, tel que de l’eau ou de l’huile, sur l’objectif. Placez le détecteur externe d’autocorrélateur sur la platine du microscope et positionnez-le directement au-dessus de l’objectif. Allumez maintenant les miroirs du galvanomètre à balayage pour régler leur tension à 0.

Ouvrez l’obturateur et utilisez une cible fluorescente pour confirmer que le faisceau atteint le détecteur externe. Réglez le détecteur d’autocorrélateur pour qu’il soit le détecteur externe. Ajustez ensuite la position de la platine jusqu’à ce que le signal apparaisse.

Ajustez les coefficients polynomiaux du formateur d’impulsions pour minimiser de manière itérative la largeur d’impulsion mesurée par l’autocorrélateur. À mesure que la largeur d’impulsion diminue, réduisez la plage de balayage en conséquence pour améliorer la précision et la visualisation de la fonction d’autocorrélation. Assurez-vous que l’entrée laser de la fibre de cristal photonique est bloquée et allumez le laser.

Laissez le laser se réchauffer pendant 30 minutes. Vérifiez que le trajet du faisceau est exempt d’obstructions, puis placez un wattmètre optique dans le trajet du faisceau juste avant la fibre à cristaux photoniques. Appuyez sur le bouton de commande pour ouvrir l’obturateur 1 et mesurer la puissance d’entrée.

Fermez à nouveau l’obturateur 1. Déplacez le wattmètre à la sortie de la fibre de cristal photonique après le miroir parabolique. Ouvrez l’obturateur 1 et utilisez l’étage d’entrée à trois axes pour maximiser la puissance de sortie.

Laissez la fibre de cristal photonique se réchauffer pendant 10 minutes, puis maximisez à nouveau la puissance de sortie à l’aide de l’étage à trois axes et enregistrez la transmission du PCF. Déplacez le wattmètre après le filtre à densité neutre et faites pivoter le filtre pour ajuster la puissance laser atteignant l’échantillon. Multipliez la puissance mesurée par la transmittance des optiques restantes pour déterminer la puissance de l’échantillon.

Maintenant, allumez les galvanomètres et la platine. Lancez le logiciel d’acquisition et entrez les paramètres d’imagerie souhaités. Placez l’échantillon sur la platine en utilisant le même support d’immersion que celui appliqué précédemment sur l’objectif.

Éteignez ensuite les lumières de la pièce et fermez les rideaux pour empêcher la lumière ambiante de pénétrer. Ensuite, allumez les alimentations et les amplificateurs du détecteur. Fermez la boîte lumineuse entourant la platine du microscope.

Utilisez les interrupteurs de commande électroniques pour ouvrir manuellement les volets du détecteur 3 à 6. Dans le logiciel d’acquisition, appuyez sur l’option Cliquer pour démarrer l’acquisition pour commencer l’imagerie SLAM. Ajustez la mise au point du microscope à l’aide du bouton de commande de la platine jusqu’à ce que l’échantillon soit clairement visible.

Utilisez le joystick de la commande de la platine du microscope pour trouver le champ de vision souhaité. Une fois positionné, cliquez sur Arrêter et réinitialiser. Sous l’onglet Enregistrement, basculez Enregistrer les données sur Oui.

Appuyez ensuite sur l’option Cliquez pour démarrer l’acquisition et attendez que l’imagerie soit terminée. Pour manipuler l’échantillon pendant l’imagerie, fermez les obturateurs du détecteur et utilisez une lampe de poche ou une lampe frontale pour l’éclairage. Après les réglages, revenez à la configuration de l’imagerie.

Pour terminer l’acquisition d’images, fermez les volets du détecteur, éteignez les détecteurs, puis allumez les lumières de la pièce. Bloquez le laser à l’aide de l’obturateur 1, puis éteignez le laser. Éteignez les galvanomètres et la platine et fermez le logiciel d’acquisition.

Éliminez l’échantillon de tissu de manière appropriée et nettoyez le poste de travail. Une fibre cristalline photonique correctement clivée présentait une face d’extrémité plate perpendiculaire à son axe et une face propre. Les fibres cristallines photoniques mal clivées présentaient des coupures inclinées, des visages ébréchés et des rayures ou des débris prononcés à la surface.

Une manipulation inappropriée ou une contamination a entraîné une accumulation visible de saleté et de particules autour de la surface de la fibre, obscurcissant le motif des trous d’air. Un noyau brûlé avec des régions sombres indiquait une fibre cristalline photonique endommagée en fin de vie. Le spectre du supercontinuum couvrait environ 975-1, 175 nanomètres avec un sommet plat et des modulations spectrales distinctes.

L’autocorrélation des impulsions après compression a montré un profil symétrique avec un demi-maximum étroit sur toute la largeur, indiquant une bonne mise en forme des impulsions. Des sources supercontinuum fonctionnant correctement produisaient de puissants signaux de deuxième et troisième harmoniques. Un supercontinuum rétréci entraînait une perte d’intensité du signal de troisième harmonique tout en conservant le signal de deuxième harmonique.

L’absence de mise en forme des impulsions a considérablement réduit tous les signaux non linéaires, ce qui a donné une image faible et peu contrastée. L’imagerie SLAM réussie du tissu rénal ex vivo a montré des structures néphroniques distinctes avec de multiples signaux optiques puissants, y compris la génération de troisièmes harmoniques et la fluorescence NADPH. Les fibres de collagène interstitielles rénales étaient identifiables par de forts signaux de génération de seconde harmonique.

L’image du rapport redox indiquait un métabolisme mitochondrial aérobie élevé dans les tubules proximaux du cortex rénal par rapport à la moelle. Une deuxième carte du rapport redox a confirmé la variation spatiale du métabolisme oxydatif et glycolytique, renforçant l’utilisation différentielle de l’énergie dans le tissu.