Name: Microscopie multi-harmonique à autofluorescence simultanée sans marquage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Découvrez la microscopie SLAM sans marquage pour l'imagerie multimodale de tissus biologiques. Cette technique capture quatre signaux simultanés pour étudier les structures cellulaires et les mécanismes pathologiques.

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La microscopie optique non linéaire exploite la réponse d’un échantillon à un rayonnement optique intense (lumière avec des champs électriques supérieurs à 3 × 103 V/cm) pour dériver le contraste de l’image, où la polarisation induite (et donc le signal généré) dépend de manière non linéaire de l’intensité incidente 1,2,3. Parce que ces multiples contrastes sont chacun médiés par différentes interactions lumière-matière, la microscopie non linéaire offre un accès simultané à des informations uniques concernant à la fois la morphologie et le paysage chimique d’un spécimen 1,2,3. Alors que les techniques de microscopie traditionnelles impliquant une interaction linéaire avec la lumière d’éclairage permettent également une imagerie quantitative, la microscopie non linéaire permet une approche plus multimodale, ayant souvent une profondeur d’imagerie et une coupe optique améliorées, tout en causant moins de photodommages à l’échantillon4. Dans le contexte d’applications biomédicales, telles que l’évaluation histologique peropératoire des tissus 5,6, cette technique permet de sonder directement les biomolécules natives, facilitant ainsi l’investigation sans couture des cellules vivantes sans avoir besoin de marqueurs ou de modifications externes. Cette approche évite l’utilisation de marqueurs, de marqueurs7, de molécules exogènes, de protéines fluorescentes génétiquement exprimées ou de nanoparticules, qui non seulement nécessitent un travail intensif, mais ont également le potentiel de perturber la biochimie native de l’échantillon et d’avoir un impact négatif sur les cellules ou les tissus cibles 8,9,10. Ainsi, le microscope non linéaire constitue un outil analytique puissant et authentique qui fournit une imagerie continue des structures microscopiques sans altérer l’intégrité chimique et structurelle de l’échantillon. Cette capacité ouvre un large éventail d’applications, allant du diagnostic et de la découverte de médicaments à la signalisation cellulaire et à la biologie des systèmes.
Les contrastes multiphotoniques tels que l’autofluorescence à deux photons (2PAF), l’autofluorescence à trois photons (3PAF), la génération de deuxième harmonique (SHG) et la génération de troisième harmonique (THG) confèrent chacun des avantages analytiques dans la caractérisation des échantillons. 2Le PAF est généré par des flavines endogènes, la flavine adénosine dinucléotide (FAD) étant la plus abondante dans les systèmes biologiques11. 3PAF exploite l’excitation proche infrarouge pour visualiser des chromophores intrinsèques tels que le NAD(P)H et permet l’imagerie métabolique tout en contournant les problèmes de phototoxicité et d’atténuation liés aux UV12. SHG révèle spécifiquement des structures moléculaires non centrosymétriques telles que le collagène fibrillaire (types I, II et III) et les réseaux de protéines 13,14,15,16,17, fournissant des informations structurelles 1. Enfin, le THG, sensible aux interfaces et aux petites caractéristiques structurales, excelle dans l’imagerie des distributions lipidiques et des vésicules extracellulaires 18,19,20,21,22.
Chacun de ces signaux de contraste a été exploré indépendamment par des groupes de recherche, établissant le créneau de la microscopie non linéaire multiphotonique en tant qu’outil fiable et polyvalent pour les applications biologiques 23,24,25,26. Ces efforts ont été menés par les inventeurs du microscope 2PAF, qui ont exploité leur technologie innovante pour mieux comprendre la morphologie des tissus, le métabolisme cellulaire et même les caractéristiques morphofonctionnelles de pathologies telles que la maladie d’Alzheimer et le cancer23. Leurs travaux ont finalement conduit à des applications révolutionnaires en neurosciences27,28. Au cours des années suivantes, plusieurs chercheurs ont mis en évidence la sensibilité du SHG aux modifications de la matrice extracellulaire, l’échafaudage qui fournit un soutien structurel aux cellules et qui subit des altérations substantielles au cours de la pathogenèse du cancer29. Notamment, Campagnola et al.14,24,30,31 ont démontré que la microscopie SHG permet de visualiser des assemblages macromoléculaires et supramoléculaires, révélant des détails tels que l’arrangement, la concentration et le type de collagène qui ne sont pas détectables avec les techniques conventionnelles basées sur la fluorescence. Ces résultats ont souligné le potentiel de la microscopie SHG en tant qu’outil de diagnostic viable en milieu clinique. Enfin, la microscopie THG a été appliquée avec succès pour visualiser les couches rétiniennes chez les rongeurs à une résolution subcellulairede 25, cartographier les structures cérébrales32 et capturer la topographie multi-interfaciale de l’invasion cellulaire du mélanome33.
Ces mises en œuvre historiques de la microscopie non linéaire impliquaient généralement un laser femtoseconde (fs) à verrouillage de mode couplé à un objectif à haute ouverture numérique (NA) pour générer et collecter les signaux non linéaires, qui étaient ensuite dirigés avec un miroir dichroïque vers un filtre passe-bande et collectés avec un tube photomultiplicateur (PMT)34. Malgré des implémentations similaires, la plupart des applications se sont concentrées sur l’acquisition d’un seul ou, tout au plus, de deux contrastes, tout en négligeant les autres. Pour réaliser pleinement le potentiel du microscope multiphotonique, Boppart et al. ont d’abord mis en œuvre l’acquisition séquentielle de plusieurs contrastes non linéaires 21,35,36,37, suivie de leur détection simultanée 4,22,38,39,40,41. La technique résultante, connue sous le nom de microscopie multiharmonique à autofluorescence simultanée sans marquage (SLAM), co-enregistre spatialement et temporellement les signaux non linéaires 2PAF, 3PAF, SHG et THG par excitation à injection unique et détection multiplex, ce qui permet d’obtenir une puissance analytique supérieure. La co-localisation spatio-temporelle de ces quatre canaux fournit des données hautement classées et riches en fonctionnalités42, offrant des avantages par rapport aux données acquises séquentiellement en éliminant les artefacts de mouvement et en assurant un meilleur recalage des images. Par conséquent, le SLAM permet de générer des caractéristiques composites, telles que des rapports optiques de réduction-oxydation, qui caractérisent efficacement les propriétés métaboliques 43,44,45. De plus, l’analyse combinée des signaux à travers les modalités facilite l’ingénierie de caractéristiques supplémentaires basées sur la corrélation et la colocalisation des canaux. Par exemple, Shi et al. ont démontré l’importance des caractéristiques de colocalisation de la microscopie SLAM dans la classification précise des cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) utilisées dans la production pharmaceutique42. De cette façon, le SLAM jette les bases de ce qui est aujourd’hui considéré comme l’état de l’art en microscopie multiphotonique, ouvrant ainsi la voie à de futures avancées dans le domaine46.
Dans ce protocole, nous décrivons les composants clés d’un microscope SLAM (Figure 1) et décrivons une méthodologie étape par étape pour sa mise en œuvre. Cela comprend la génération et la mise en forme des impulsions d’excitation, la préparation représentative des échantillons de tissus, les procédures d’imagerie et le traitement, ainsi que l’affichage des données résultantes. En utilisant une technologie prête à l’emploi et des techniques établies, ce protocole est universel, transférable et peut être facilement reproduit à l’aide de systèmes optiques similaires dans différents laboratoires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg"> 
Figure 1 : La conception optique d’un microscope à autofluorescence multiharmonique (SLAM) sans marquage simultané. Le laser femtoseconde émet une lumière de 1040 nm en impulsions de 370 fs à un taux de répétition de 10 MHz. L’intensité et la polarisation du laser sont soigneusement contrôlées avant de pomper un cristal photonique pour générer un supercontinuum. Les impulsions sont ensuite compressées par un façonneur d’impulsions et dirigées vers un microscope à balayage laser personnalisé (boîte en pointillés). Les miroirs dichroïques et les filtres passe-bande isolent les signaux non linéaires générés par l’échantillon avant qu’ils ne soient détectés par des détecteurs de photons à haute sensibilité tels que les tubes photomultiplicateurs (PMT) ou les photodétecteurs hybrides (HPD). La conception optique est basée sur un système41 décrit précédemment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Platine 3 axes</td><td>ThorLabs</td><td>MAX316</td><td>Abandonné.</td></tr><tr><td>Boîte d’imagerie à fond en verre de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Verre de protection #0 non traité.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063029</td><td>Glycémie élevée, HEPES, pas de rouge de phénol.</td></tr><tr><td>Suppléments de milieu de croissance des cellules endothéliales</td><td>PromoCell</td><td>Réf. C-39210</td><td>Omettre le sérum de veau fœtal.</td></tr><tr><td>Laser femtoseconde FemtoTrain</td><td>Spectra-Physique</td><td>1040-5</td><td>Puissance moyenne : >5,0 W, Énergie d’impulsion : >500 nJ, Longueur d’onde : 1040 nm &plusmn ; 8 nm, taux de répétition : 10 MHz, largeur d’impulsion (FWHM) : < 220 fs.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03</td><td>Caractérisation de HyClone.</td></tr><tr><td>Décapant de fibres</td><td>ThorLabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>Flavine adénine dinucléotide sel disodique hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. F6625</td><td></td></tr><tr><td>Miroirs galvanomètres</td><td>Technologie Cambridge</td><td>6215H</td><td>Abandonné.</td></tr><tr><td>Poste de travail pour l’usinage du verre</td><td>Vytran</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Laboratoire Eliceiri à l’Université du Wisconsin à Madison</td><td>Version 2.16.0</td><td>FIJI Distribution.</td></tr><tr><td>Papier de soie Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark Professionnelle</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cytiva</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>Platine de microscope</td><td>Instrumentation scientifique appliquée</td><td>FTP-2050</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de platine de microscope</td><td>Instrumentation scientifique appliquée</td><td>MS-2000-500-UDSW</td><td></td></tr><tr><td>Autocorrélateur de microscopie</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>Carpe</td><td></td></tr><tr><td>Lentille d’objectif</td><td>Olympe</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Immersion dans l’eau, grossissement 25X, 1,05 NA.</td></tr><tr><td>Wattmètre optique</td><td>Newport</td><td>Référence 919P-003-10</td><td>600 à 1700 milles marins.</td></tr><tr><td>Analyseur de spectre optique</td><td>ThorLabs</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>Fibre cristalline photonique</td><td>Photonique NKT</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>Grande zone de mode, maintien de la polarisation. Diamètre du noyau : 15 & micro ;m.</td></tr><tr><td>Couperet à fibre optique de précision</td><td>Fujikura</td><td>CT-101</td><td></td></tr><tr><td>Façonneur d’impulsions</td><td>Solutions Biophotonique Inc.</td><td>FemtoJock-D</td><td>Abandonné.</td></tr><tr><td>&bêta ;-Nicotinamide adénine dinucléotide, hydrate de sel disodique réduit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

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