Name: Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez une méthode améliorée de knockout conditionnel oocytaire chez le poisson-zèbre utilisant la lignée knock-in zpc:cas9 et la livraison Tol2. Cette technique permet une production rapide et efficace de mutants maternels pour étudier les facteurs maternels.

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<ol><li>Fuentes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+coordinate+system%3A+Molecular-genetics+of+embryonic+axis+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish.</a> Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Huluwa+dictates+the+embryonic+body+axis+through+%CE%B2-catenin+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates.</a> Science. 362 (6417), eaat1045(2018).</li>
<li>Abrams, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+maternally-controlled+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions.</a> PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24+controls+poly%28A%29+tail+length+and+translation+efficiency+of+crystallin+mRNAs+in+the+lens+via+cytoplasmic+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).</li>
<li>Weidinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Xing, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+dishevelled+genes+in+zebrafish+reveals+distinct+functions+in+embryonic+patterning+and+gastrulation+cell+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements.</a> PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).</li>
<li>Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+program+of+oocytes+can+be+modified+in+vivo+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary.</a> J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+maternal+mutants+via+oocyte-specific+knockout+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system.</a> Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+maternal+mutants+via+oocyte+transgenic+expression+of+CRISPR-Cas9+and+sgRNAs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish.</a> Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+targeting-mediated+and+endogenous+gene+integrity-maintaining+knockin+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24a+dictates+mRNA+recruitment+for+germ+granule+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish.</a> EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T5+exonuclease-dependent+assembly+offers+a+low-cost+method+for+efficient+cloning+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+conditional+mutagenesis+using+transgenic+expression+of+Cas9+and+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs.</a> Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).</li>
<li>Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+zebrafish+cells+by+conventional+pneumatic+microinjector%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector.</a> Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Aharon, D., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Sexual determination in zebrafish.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+early+embryonic+primordial+germ+cells+promotes+zebrafish+female+differentiation+as+revealed+by+lifetime+labeling+of+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline.</a> Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+formation+of+primordial+germ+cells+from+zebrafish+blastomeres+by+germplasm+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors.</a> Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Bertho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dazl+regulates+cystogenesis+and+germline+stem+cell+specification+during+the+primordial+germ+cell+to+germline+stem+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition.</a> Development. 148 (7), dev.187773(2021).</li>
<li>Houwing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Piwi+and+piRNAs+in+germ+cell+maintenance+and+transposon+silencing+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish.</a> Cell. 129 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetally+localised+Vrtn+functions+as+a+novel+repressor+to+modulate+bmp2b+transcription+during+dorsoventral+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish.</a> Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x mélange PCR M5 HiPer Taq</td><td>Mei5bio</td><td>Réf. : #MF001-BD-100</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>MDbio</td><td>N° de chat#A006L</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep Plasmid Miniprep Kit</td><td>Axygen</td><td>Réf.#AP-MN-P-4</td><td></td></tr><tr><td>Instrument d’électrophorèse capillaire (Qsep400)</td><td>BiOptique</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mélange d’étiquetage DIG</td><td>Roche</td><td>Réf. #11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>Réf. #4716728001</td><td></td></tr><tr><td>La TNT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf. #R0861</td><td></td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc premier brin</td><td>TransGen Biotech</td><td>N° de catalogue (Cat#AT301)</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase GenCrispr NLS-Cas9-NLS</td><td>GenScript</td><td>Réf. #Z03389</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre (1,0 x 100 mm)</td><td>Usine d’équipement éducatif Rantai</td><td>Réf.#OS-2B</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>BBI Sciences de la vie</td><td>Réf. #28985</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>Pavé graphique</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Libre</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Biotechnologie</td><td>Réf. #CA1351</td><td></td></tr><tr><td>Microforge (MF2)</td><td>NARISHIGE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micro-spectrophotomètre (Nano-300)</td><td>ALLSHENG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OlyVIA</td><td>OLYMPE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>Réf. #15140122</td><td></td></tr><tr><td>Injecteur de picolitres (PLI-100A)&nbsp ;</td><td>Appareil de Harvard</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler pointue</td><td>WPI</td><td>Réf. #500341</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler pointue</td><td>&nbsp ; WPI&nbsp ;</td><td>500341</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur (PC-100)</td><td>NARISHIGE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase RiboLock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf.#EO0381</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf. #R0481</td><td></td></tr><tr><td>Perles magnétiques hydroxyles de silicium</td><td>Sangon Biotech</td><td>Réf. #B518720-0001</td><td></td></tr><tr><td>ARN polymérase T7</td><td>ONÉ</td><td>Réf. #M0251L</td><td></td></tr><tr><td>Zold</td><td>WPI</td><td>Moules en Z Cat#</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

Generation of Maternal Mutants Using zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

Génération rapide de mutants maternels rbm24a Nous avons construit un vecteur transgénique permettant l’expression d’un marqueur BFP maternel et de quatre ARNsg très efficaces ciblant la séquence codante rbm24a. Suite à l’introduction de ce vecteur dans des embryons homozygotes de rbm24a-RFP KIzpc :cas9 par transposition de Tol2, Mrbm24a a été facilement et rapidement identifié parmi les embryons F1 BFP-positifs...

Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

Oogenesis and early embryonic development are critically dependent on maternally derived mRNAs and proteins. Eliminating these maternal factors ...

generation-of-maternal-mutants-using-zpccas9-knock-in-zebrafish

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d'ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

Un guide étape par étape pour générer ciblées embryons de poissons zèbres chimérique par transplantation au stade blastula ou de gastrula.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

Cette vidéo décrit une technique de micro-injection d’embryons pour délivrer des composés dans le sac vitellin du poisson-zèbre.

Microinjection d’embryons : une technique pour délivrer un composé dans le jaune de poisson-zèbre

Le poisson-zèbre est un système modèle puissant pour la biologie du développement et la recherche sur les maladies humaines en raison de sa similitude génétique avec les vertébrés supérieurs. Ce protocole décrit une méthodologie permettant de créer des embryons de poisson-zèbre haploïde qui peuvent être utilisés pour des stratégies de dépistage avancé afin d’identifier les mutations récessives dans les gènes essentiels à l’embryogenèse précoce.

Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par<em&gt; In Vitro</em&gt; Engrais

Un protocole optimisé pour la maturation in vitro des ovocytes de poisson zèbre utilisés pour la manipulation de produits de gènes maternels est présenté ici.

Manipulation fonctionnelle du gène maternel Produits utilisant<em&gt; In vitro</em&gt; Ovocyte Maturation en Zebrafish

Le but du présent protocole est de modifier la pénétrance de lethal phénotypes mutants squelettiques chez le poisson zèbre par reproduction sélective. Mutants létaux ne peuvent pas être cultivés à l’âge adulte et se sont élevés, donc ce protocole décrit une méthode de suivi et en sélectionnant une pénétrance à travers plusieurs générations de tests de descendance.

Décalage de pénétrance de Mutant squelettique létale Zebrafish Progeny test

Édition de génome ciblé dans le système de modèle Danio rerio (poisson-zèbre) a été grandement facilitée par l’émergence des approches axées sur les CRISPR. Ici, nous décrivons un protocole simplifié et robuste pour la génération et l’identification d’allèles de dérivés CRISPR non-sens qui intègre l’analyse de mobilité hétéroduplex et l’identification des mutations à l’aide de séquençage de prochaine génération.

Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio

Le développement précoce dépend des produits hérités de la mère, et le rôle de bon nombre de ces produits est actuellement inconnu. Ici, nous avons décrit un protocole qui utilise CRISPR-Cas9 pour identifier les phénotypes d’effet maternel en une seule génération.

Déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère dans le développement précoce des croustillants maternels

Ce protocole décrit une approche visant à faciliter des modifications précises dans les embryons de poisson-zèbre à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un pipeline de phénotypage est présenté pour démontrer l’applicabilité de ces techniques à modéliser une variante génétique associée au syndrome du QT long.

Modifications précises de CRISPR-Cas9 dans les cœurs de poisson zèbre

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.

Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre

Découvrez une méthode améliorée de knockout conditionnel oocytaire chez le poisson-zèbre utilisant la lignée knock-in zpc:cas9 et la livraison Tol2. Cette technique permet une production rapide et efficace de mutants maternels pour étudier les facteurs maternels.

Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

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