Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

Ici, nous décrivons un protocole de génération de mutant maternel qui couple une ligne d’entraînement stable zpc :cas9 avec l’administration médiée par Tol2 de cassettes d’expression d’ARNsg.

Dans cette vidéo, nous présentons une méthode améliorée d’élimination de l’affection spécifique aux ovocytes chez le poisson-zèbre, offrant une plate-forme polyvalente pour étudier les facteurs maternels avec des mutations zygotiques entraînant une létalité ou une stérilité. Les méthodes actuelles d’élimination maternelle sont soit techniquement difficiles, soit chronophages. Nous avions précédemment signalé que le transgène zpc :cas9 est transcriptionnellement réduit au silence au fil des générations.

En utilisant la ligne d’inactivation zpc :cas9, nous avons établi une plate-forme robuste pour générer une inactivation conditionnelle pendant l’ovogenèse, permettant la production rapide et très efficace de mutants maternels. Pour commencer, collectez des embryons qui ont été engendrés par des poissons homozygotes rbm24a RFPKI zpc :cas9. Combinez un microlitre de poussière PGG EB rbm24a 4sGRNA avec un microlitre d’ARN messager de la transposase Tol2 pour préparer le mélange d’injection.

Diluez à la fois le plasmide et l’ARN messager Tol2 directement dans de l’eau pure. Placez maintenant une lamelle en verre dans un plat de 90 millimètres. Alignez les embryons le long du bord de la lamelle et utilisez doucement une pipette pour enlever tout excès d’eau.

Injectez ensuite deux nanolitres du mélange préparé dans le blastodisque de chaque embryon au stade d’une cellule. Rincez doucement les embryons injectés à l’eau bleue et transférez-les dans un autre plat. Placez le plat dans un incubateur réglé à 28 degrés Celsius pour la culture.

24 heures après la fécondation, sélectionnez les embryons qui présentent une expression de protéine fluorescente bleue robuste et omniprésente. Quatre jours après la fécondation, n’élevez que les embryons qui maintiennent de forts signaux fluorescents transgéniques. Collectez des embryons produits à partir de femelles fondatrices transgéniques de mosaïque d’accouplement avec des mâles de type sauvage.

À l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent, prélevez les embryons positifs à la protéine fluorescente bleue au stade unicellulaire. Fixez ensuite les embryons à des stades appropriés dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour préparer une solution OGER à 1,5 %, pesez et combinez la poudre OGER dans un tampon Ringer’s 1/3 et faites bouillir jusqu’à dissolution complète.

Versez la solution OGER fondue dans une boîte de Pétri de 90 millimètres et insérez un moule en Z dans l’agarose fondu. Une fois l’agarose solidifiée, retirez délicatement le moule pour créer une plaque prête à l’emploi. Ensuite, ajustez les paramètres de l’extracteur d’aiguille pour utiliser deux poids légers, puis sélectionnez la procédure de la première étape.

Chargez les capillaires en verre dans l’extracteur pour fabriquer des aiguilles scellées à l’état fondu. À l’aide d’une pince à épiler pointue, coupez les pointes capillaires à un diamètre de 30 à 40 micromètres. Ensuite, utilisez une microforge pour former une pointe à l’extrémité, ce qui facilitera la pénétration de l’embryon et réduira les dommages tissulaires.

Accouplez les fondatrices présumées avec des poissons-zèbres de type sauvage et collectez des embryons. Au stade unicellulaire, isolez les embryons positifs pour la protéine fluorescente bleue à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent. Trois heures après la fécondation, incubez les embryons en pronase, dissous dans un tampon de Ringer d’une force tierce pendant 10 minutes avec un pipetage doux pour les déchorionner.

Transférez soigneusement les embryons déchorionnés sur la plaque d’argarose préparée inondée de 1/3 de tampon de Ringer, complété par de la pénicilline streptomycine. Réorientez les embryons de manière à ce que le blastomère soit orienté vers l’extrémité capillaire pour l’aspiration cellulaire. Utilisez maintenant un micro-injecteur pour aspirer 20 à 40 cellules de chaque embryon en réduisant doucement la pression d’équilibre pour contrer la force d’aspiration capillaire.

Augmentez la pression d’équilibre pour libérer les cellules aspirées dans deux microlitres d’eau déminéralisée au bord des tubes Eppendorf de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 200 microlitres de réactif d’extraction d’ARN dans le tube pour laver les cellules aspirées, et placez le tube sur de la glace pour un stockage temporaire. Conservez les embryons après l’aspiration cellulaire sur la plaque d’agarose jusqu’à ce que des phénotypes aberrants soient visualisés.

Ensuite, ajoutez 40 microlitres de chloroforme aux cellules des embryons sélectionnés dans le réactif d’extraction et mélangez doucement. Ensuite, centrifugez le mélange à 12 000 G pendant une minute à température ambiante. Après avoir recueilli le surnageant, ajoutez un microlitre de solution de glycogène.

Ajoutez ensuite un volume égal d’isopropanol en fonction du volume surnageant et mélangez soigneusement. Incuber le tube à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre la précipitation de l’ARN. Centrifugez maintenant l’échantillon à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant.

Ensuite, pour laver deux fois la pastille d’ARN, ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 70 % et centrifugez à 12 000 g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, ouvrez le couvercle du tube pour laisser sécher la pastille à température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez sept microlitres d’eau pour dissoudre la pastille d’ARN.

Effectuez une transcription inverse à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc First Strand, puis effectuez une PCR et un séquençage Sanger pour analyser les mutations dans les embryons mutants maternels. Les mutants maternels rbm24a ont été identifiés par l’absence de RFP rbm24a, tandis que les autres mutants maternels ont été détectés par des phénotypes spécifiques ou un génotypage basé sur l’aspiration cellulaire. Parmi les embryons BFP positifs, ceux qui n’avaient pas de signal RFP ont été identifiés comme des mutants maternels rbm24a.

L’hybridation in situ à l’aide de la sonde NANOS3 a révélé que les embryons de Mrbm24a ne parvenaient pas à recruter des ARNm de plasma germinatif pour les granules germinaux au stade de quatre cellules et qu’ils manquaient de cellules germinales primordiales 24 heures après la fécondation. Tous les mâles adultes de Mrbm24a n’ont pas réussi à féconder les œufs pondus par les femelles de type sauvage, montrant des anomalies anatomiques avec des dépôts graisseux remplaçant les testicules normaux. L’analyse histologique a confirmé l’absence totale de cellules germinales et de spermatozoïdes dans les testicules de Mrbm24a.

L’analyse par transfert Western a confirmé des niveaux presque indétectables de protéine rbm24a chez des embryons RFP négatifs positifs à BFP. Les résultats de la RT-qPCR ont montré des niveaux de transcrit rbm24a significativement plus faibles chez les embryons BFP positifs négatifs à RFP par rapport aux témoins. La RT-PCR et le séquençage de Sanger ont révélé des délétions et des indels importants chez les embryons BFP positifs négatifs et positifs aux RFP, avec des transcrits de type sauvage détectables uniquement chez les embryons positifs aux RFP.

Un marqueur GFP maternel et des ARNsg nanog ont été introduits pour générer des mutants nanog maternels, et les embryons positifs à la GFP ont montré une gamme de phénotypes dorsalisés. Les taux de transmission germinale variaient de 12 % à 32 % parmi les lignées transgéniques positives à la GFP. Un phénotype dorsal compatible avec les mutants nanog maternels a été observé chez 22 % à 60 % des embryons positifs à la GFP.