Production par microbioréacteurs de cellules stromales mésenchymateuses dépendantes de l’ancrage, prêtes au syndrome de détresse respiratoire aiguë

Nous étudions comment les cellules interagissent avec leur environnement, y compris lors de la production ou de la fabrication de cellules à titre de thérapie. Ici, nous abordons des questions sur la manière dont des cellules dépendantes de l’ancrage telles que les MSC, le stromal mésenchymateux ou les cellules souches peuvent être produites pour surmonter certains obstacles à la traduction clinique. La reconnaissance croissante que la variabilité de la population cellulaire affecte à la fois la consistance et la puissance du produit cellulaire final pour chaque lot ou personne.

Ces défis peuvent même affecter l’approbation réglementaire de certaines thérapies cellulaires. Nous visons un écart capable d’atteindre un nombre élevé de cellules par millilitre de fluide avec un contrôle élevé de l’environnement et de manière à être amplifiée. Ce protocole permet d’inclure une surveillance environnementale en ligne pour les cellules dépendantes de l’ancrage, comme les MSC.

Ce contrôle du procédé est un avantage par rapport aux fioles encore utilisées dans la plupart des laboratoires et de la production clinique. Il existe plusieurs questions ouvertes pour les MSC et autres types cellulaires sensibles aux indices mécaniques. Par exemple, comment ce type d’approche peut-il aider à concevoir des cellules pour traiter d’autres états pathologiques ?

Pour commencer, retirez le bouchon en plastique transparent relié à la bouteille LL dans le support à bouteilles. Avec une nouvelle seringue stérile de 50 millilitres sans piston, connectez la buse à la bouteille LL. Versez l’eau filtrée stérile dans le fût de la seringue et injectez-la dans la bouteille LL. De même, remplissez la bouteille L avec 25 millilitres de DMEM à faible taux de glucose sans FBS, la bouteille R avec 25 millilitres de PBS stérile, et la bouteille RR avec huit millilitres de solution de rinçage anti-adhérence. Répétez la procédure pour préparer le nombre requis de consommables pour l’expérience.

Ensuite, effectuez un auto-test sur chaque capsule à utiliser dans l’expérience. Une fois que la capsule a réussi tous les contrôles de l’auto-test, retirez les cassettes auto-test et placez-les dans des sacs de stockage protégés contre la lumière. Montez le consommable sur le bioréacteur.

Retirez le ruban adhésif vert des vannes des consommables et installez le consommable dans le module. Réinstallez les serre-joints et vérifiez s’il y a un sifflement pour confirmer un joint solide. Connectez la ligne de capteur de pression blanche, la ligne de pression d’air rouge et la ligne de vide bleue entre le consommable et la station de base ou la capsule.

Vérifiez que le port d’injection latéral est fermé avec une pince goutte blanche avant de commencer une nouvelle expérience. Cliquez sur l’icône Flush Bottles dans l’interface logicielle. Activez le bouton radio pour la bouteille L, sélectionnez Sortie vers les déchets, puis cliquez sur Démarrer Flush MSCserum.

Dans la fenêtre du contenu de la bouteille, indiquez que MSCserum se trouve dans la bouteille R, qui contient PBS. Ensuite, allez dans les opérations manuelles et effectuez trois cycles d’éjection et de lavage sur la bouteille de déchets. Dans la fenêtre Contenu de la bouteille, il est indiqué que MSCserum est désormais situé dans la bouteille RR, qui contient la solution de rinçage anti-adhérence.

Retournez en Opérations manuelles et effectuez un cycle d’éjection-lavage sur la bouteille de déchets. Après 30 minutes, rincez le consommable avec du PBS. Vide le réacteur en attendant l’injection de cellules et de microporteurs.

Dans le panneau des opérations manuelles, cliquez sur Reinoculer. Laissez le système en pause à l’étape où le tableau de bord affiche une invite pour inoculer le réacteur. Ensuite, pipettez un volume calculé de cellules en suspension dans un tube conique de 15 millilitres contenant des microporteurs pour chaque condition.

Complétez chaque tube entre 2,2 et 2,5 millilitres avec un milieu cellulaire mésenchymateux humain frais et chaud. En travaillant avec un ou deux consommables à la fois, retirez-les de la station de base et apportez-les dans l’armoire de biosécurité. Retirez le mélange de cellules et de microporteurs dans une seringue de cinq millilitres à l’aide d’une aiguille émoussée verte de quatre pouces.

Injectez le mélange dans le réacteur. Tenez la conduite du port d’injection près de la base de la cassette en veillant à ne pas détacher la ligne. En effectuant un mouvement de roulement entre le pouce et l’index, tournez la ligne du port d’injection sur deux rotations complètes afin de créer un nœud dans la ligne.

Glissez le nœud dans l’espace de découpe près de la base de la porte d’injection et fixez-le avec un petit morceau de ruban de laboratoire. Ensuite, remettez le consommable à la station de base. Après avoir répété l’injection pour tous les consommables, naviguez dans l’interface logicielle pour indiquer que l’inoculation est terminée.

Lorsque le logiciel revient sur la page d’accueil, retirez la serre blanche des lignes de sortie des consommables. Entrez en manuel et effectuez la fonction d’éjection d’excès avec le port de sortie réglé sur P pour la perfusion. Activez le mode de mélange statique en utilisant un cycle de 1 680 secondes allumé et 120 secondes éteint, et réglez la fréquence de mélange à cinq hertz.

Pour commencer la prélèvement cellulaire, utilisez une seringue d’un millilitre pour extraire 200 microlitres de Pronase et environ 300 à 400 microlitres d’air. Dévissez le bouchon sur la conduite d’injection latérale et vaporisez le connecteur de valve sans aiguille avec 70 % d’éthanol. Retirez le ruban de la ligne d’injection latérale nouée, dénouez le nœud et déserrez la pince en forme de larme blanche.

Maintenant, connectez la seringue d’un millilitre et injectez doucement la Pronase dans le réacteur. Poursuivez le liquide avec de l’air pour assurer une livraison complète. Réengagez la serre-goutte et rebouchez la ligne d’injection.

Ensuite, remettez le consommable dans le pod, reconnectez toutes les conduites, retirez la pince blanche en C et reprenez le mélange. Mettez la bouteille de déchets et la bouteille source de médias sur la glace. Démarrez un minuteur de cinq minutes et laissez la Pronase digérer les microporteurs dans le réacteur.

Après cinq minutes, vérifiez que les microporteurs se sont dégradés en vérifiant leur absence dans le réacteur. Récoltez les cellules en entrant dans Opérations manuelles, réglez le nombre de cycles à trois, choisissez Port de sortie W pour les déchets, puis cliquez sur Éjecter Lavage. Après la fin des cycles de lavage d’éjection, transférez le consommable dans l’armoire de biosécurité.

Ensuite, retirez le contenu de la bouteille de déchets à l’aide d’une seringue de 10 ou 20 millilitres. Distribuez le contenu de la bouteille de déchets dans un tube centrifugeuse conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 300g pendant cinq minutes.

Aspirez le surnageant et évaluez la taille des granules cellulaires. Les conditions environnementales, notamment le pH, la température, l’oxygène dissous et le dioxyde de carbone, ont été maintenues de manière stable tout au long de la période de culture de 10 jours dans le système microbioréacteur. La variation du pH était significativement plus faible dans le microréacteur que dans la culture tissulaire en flasque en polystyrène.

Le rendement cellulaire était plus élevé dans le microbioréacteur que dans la fiole T25 tout en maintenant une viabilité cellulaire similaire. Sur les 14 attributs de qualité critique mesurés associés à la puissance, neuf ont montré une expression significativement plus élevée d’ARNm dans l’état du micro-opérateur par rapport au flasque T75.