Explorer les interactions protéine-glycane : progrès de la résonance magnétique nucléaire

Nous étudions les interactions protéine-protéine et protéine-glycane, en nous concentrant sur le complexe intégrine-désintégrine. Notre modèle explore la dynamique structurelle et met en évidence le rôle de la force de surface dans la médiation de la formation complexe et de la stabilité de l’interaction. Notre groupe se consacre à l’étude du rôle des forces de surface dans la reconnaissance moléculaire et l’évolution des sites de liaison en étudiant les amas hydrophobes de surface présents dans les protéines.

La solution RMN permet de détecter les interactions protéiques. Bien que les interactions faibles soient essentielles à la vie, il existe un biais vers les complexes de haute affinité, même s’ils sont présents dans de nombreuses fonctions biologiques importantes. Notre groupe se concentre sur l’utilisation d’approches de biologie structurale intégrative pour étudier les grands complexes protéiques.

Nous utilisons la RMN comme outil principal pour étudier la dynamique et les aspects fonctionnels. Pour commencer, préparez une solution de quatre millimolaires de D-mannose dans un tampon de phosphate de sodium à pH 7,4 avec 50 millimolaires de chlorure de sodium et 5 % d’oxyde de deutérium. Divisez la solution en deux échantillons, l’un contenant 80 CVN micromolaires, et le second sans.

Pour cartographier la liaison du ligand par perturbation par décalage chimique sur le spectromètre RMN, configurez la séquence d’impulsions HSQCTOPSI pour l’acquisition H1C13 HSQC. Configurez le domaine temporel, la largeur spectrale, la fréquence porteuse et le nombre de balayages. Calculer la perturbation par déplacement chimique à l’aide de l’équation fournie.

Pour cartographier la liaison du ligand par la différence de transfert de saturation, créez d’abord un nouvel ensemble de données. Configurez les paramètres des expériences de RMN STD en criblant différentes fréquences de saturation ou en fixant la fréquence tout en faisant varier les temps de saturation pour évaluer l’accumulation. Mettre en place des expériences RMN 1D H1 à l’aide de la séquence d’impulsions ZGPR.

Réglez le spectromètre sur H1, effectuez un calage et mesurez une impulsion dure de 90 degrés. Centrez la fréquence porteuse à environ 4,7 parties par million, ce qui correspond au signal d’eau, puis sélectionnez le STDDIFFESGP. 3 et réglez les paramètres d’acquisition.

Réglez la largeur spectrale selon les besoins, le délai d’interbalayage D1 à quatre secondes et définissez le temps de saturation D20, conformément aux objectifs de l’expérience. Chargez la liste FQ2 avec une fréquence hors résonance à moins 40 parties par million et des fréquences à résonance pour saturer uniquement les protéines. Testez les fréquences de résonance de moins 0,59, 0,73 et 8,1 parties par million pour déterminer les conditions optimales.

Utilisez la fréquence optimale pour acquérir des spectres STD à des temps de saturation de 0,5, un, 1,5, deux, 2,5, trois et quatre secondes. Tracez les valeurs ASTD correspondantes en fonction du temps de saturation. Maintenant, réglez le nombre de balayages à 64 et faites la moyenne de la boucle d’expérience quatre fois.

Ensuite, calculez le nombre total de scans. Réglez le délai entre les balayages à quatre secondes et le temps d’acquisition à 2,7262976 secondes. Configurez l’impulsion de saturation en réglant la durée sur 50 millisecondes et le contrôle de la forme gaussienne via le programme en forme 9SP9.

Appliquez un filtre de ligne T1 dans la variante RMN STD, puis réglez le temps de verrouillage de spin D29 en fonction de la taille de la protéine. Pour cartographier le ligand de liaison H1 R2, sélectionnez d’abord le programme d’impulsions CPMG_ESGP2D dans la bibliothèque standard Bruker. Définissez l’expérience comme une acquisition 2D.

Configurez les paramètres d’acquisition comme indiqué. Ensuite, exécutez l’expérience pendant 200 cycles de huit balayages chacun. Ajustez la liste des compteurs variables en fonction de la durée totale souhaitée du cycle CPMG.

Effectuez deux expériences, l’une pour l’échantillon contenant la protéine et l’autre pour l’échantillon contenant uniquement le ligand. Tracez les spectres H1 pour chaque TCPMG à l’aide de la commande EFP ou sinus M suivi de FP, puis ajustez la fonction de fenêtre en fonction de la meilleure stratégie de traitement. Calculez le quotient de RPCG Q à l’aide de l’équation.

Acquérir H1N15HSQC spectres de CVN marqué N15 à 298 Kelvin. Titrez avec du D-mannose pour atteindre les concentrations finales de zéro, un, deux, cinq, 10, 20, 40 et 60 millimoles. Utilisez une séquence d’impulsions HSQC FHSQCF3GPPH rapide sensible à la phase de la bibliothèque standard Bruker.

Ensuite, calculez la perturbation par déplacement chimique à l’aide de la formule. Tracer les valeurs CSP pour chaque résidu en fonction de la concentration de D-mannose afin de déterminer la constante de dissociation KD à l’aide de l’équation cinq. Ensuite, ajustez les données résultantes à une seule isotherme de liaison à l’aide de la formule.

Utilisez une séquence d’impulsions HSQCT2ETF3GPSI3D sensible à la phase et configurez les paramètres comme indiqué pour mesurer les valeurs N15 R2 des résidus individuels de résidus CVN en l’absence et la présence de 60 millimolaires de D-mannose à 298 Kelvin. Traitez des spectres pseudo-tridimensionnels à l’aide de NMRPipe pour générer des spectres de type HSQC pour chaque retard de relaxation. Importez les spectres traités dans une plateforme d’analyse.

Ensuite, sélectionnez tous les spectres et appliquez l’outil de suivi des changements d’intensité. Tracez l’intensité de chaque pic transversal en fonction de T relax et ajustez la décroissance à une fonction monoexponentielle pour extraire les valeurs N15 R2 de chaque résidu. Calculez l’erreur expérimentale à partir du rapport signal/bruit des spectres de type HSQC à 67,84 millisecondes.

Traitez une région du spectre contenant uniquement du bruit et convertissez-la en un fichier texte à l’aide de la commande donnée. Ensuite, déterminez l’écart-type de la région de bruit ou de l’intensité du bruit à l’aide d’un logiciel statistique. Calculez l’erreur expérimentale à l’aide de l’équation donnée.

Des perturbations chimiques ont été observées pour les deux formes anomériques de D-mannose en présence de CVN, avec des changements plus importants observés pour le bêta-D-mannose, indiquant une liaison préférentielle. Deux pics distincts ont été observés pour la plupart des hydrogènes D-mannose en présence de CVN, correspondant à l’état libre et à l’état lié. Les noyaux d’hydrogène présentant les valeurs ASTD les plus élevées étaient associés au bêta-D-mannose, ce qui correspond à de fortes interactions bipolaires avec le CVN.

Dans l’analyse du taux de relaxation transversale, H bêta quatre était le seul proton qui présentait une augmentation notable de la relaxation lors de la liaison à CVN. Les perturbations du décalage chimique H1 et N15 induites par l’ajout d’un ligand étaient les plus élevées à une concentration allant jusqu’à 10 millimolaires. Les résidus I40, E41, N42, V43, D44 et G45 dans le brin bêta ont montré des perturbations chimiques significatives, les identifiant comme le site de liaison à haute affinité pour le D-mannose.

Les isothermes de liaison ont montré que le résidu D44 avait la plus grande affinité parmi les résidus du brin bêta, avec une constante de dissociation d’environ un millimolaire. La mesure des taux de relaxation de N15 R2 a montré à la fois des augmentations et des diminutions des valeurs delta R2 lors de la liaison du D-mannose, suggérant un mélange de processus de stabilisation et d’échange conformationnels. Les résidus C58, R59, K74 et R76 ont montré une augmentation des valeurs delta R2, confirmant leur implication dans le site de liaison de haute affinité, tandis que les résidus F4, C8, R24 et G27 représentaient la région de faible affinité.