Amélioration de l’édition du génome via une technique d’électroporation in vivo basée sur l’administration d’acides nucléiques oviductaux pour la génération de souris knock-out

Le champ d’application de nos recherches est de simplifier la génération de souris knockout en utilisant l’électroporation in utero, délivrant directement des composants d’édition génomique dans les oviductes des femelles enceintes. Les micro-injections dans les zygotes nécessitent de maintenir un grand nombre d’animaux, y compris des femelles donneuses et receveuses ainsi que des mâles vasectomisés. Par conséquent, des protocoles minimisant l’utilisation des animaux sont préférables.

L’utilisation du système Nepa21 pour l’électroporation des zygotes offre une opportunité unique de générer des souris knockout génétiques ciblées en une seule étape, avec une efficacité comparable à celle des techniques standard basées sur l’injection nucléaire. Pour commencer, utilisez des outils d’analyse computationnelle pour identifier les séquences d’ARN guide unique ciblant le gène d’intérêt sélectionné. Sélectionnez des séquences situées dans les exons aussi proches que possible du site de mutation souhaité. Utilisez un navigateur génomique pour croiser la structure de l’exome et prioriser les séquences présentes dans la plupart des isoformes de sépissage.

Analysez l’activité prédite hors cible de chaque séquence de guides à l’aide du système de notation intégré de l’outil. Choisissez des séquences qui démontrent la plus faible probabilité de liaison hors cible. Pour produire un gabarit linéaire d’ADN double brin, préparez le mélange maître PCR en utilisant les composants spécifiés dans le tableau donné.

Ajoutez la polymérase en dernier et gardez le mélange maître sur la glace pour préserver la stabilité enzymatique. Ensuite, effectuez la PCR en utilisant les conditions de cycle thermique suivantes. Ensuite, préparez le mélange maître de transcription in vitro avec les composants donnés et incubez la réaction pendant 1,5 heure à 37 degrés Celsius à l’aide d’un thermocycleur pour un contrôle de température constant.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de DNase I à la réaction. Incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes supplémentaires pour digérer le modèle d’ADN, puis inactivez l’enzyme à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après la purification de l’ARN par Trizol, mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et vérifiez les rapports A260-A280 et A260-A230.

Pour préparer le complexe ribonucléoprotéique à la transfection, diluez un tampon molaire de Tris-HCl à une concentration de 100 millimolaires à l’aide d’eau sans nucléase. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre à seringue d’une taille pore de 0,022 micromètre. Alyquote en portions de 10 microlitres et conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Ensuite, préparez le mélange de transfection en utilisant la nucléase spCas9, l’ARN guide simple et le Tris-HCl dilués avec de l’eau DEPC dans un tube sans nucléase. Incubez le mélange de transfection à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour permettre la formation du complexe ribonucléoprotéique. Ensuite, aliquotez le mélange de transfection en petits volumes adaptés à des sessions I-GONAD uniques et maintenez-le à quatre degrés Celsius pour préserver l’activité des réactifs.

Après avoir accouplé des femelles CD1 avec des souris mâles CD1 à un seul logement pendant la nuit, vérifiez la présence d’un bouchon copulatoire chez chaque femelle. Transférez uniquement les femelles ayant des bouchons visibles dans une nouvelle cage pour des procédures expérimentales ultérieures. Autoclave tous les instruments chirurgicaux en acier inoxydable pour garantir la stérilité avant utilisation.

Ensuite, pèser le bouchon sélectionné=souris femelles positives à l’aide d’une balance électronique avant de les anesthésier. Surveillez les souris anesthésiées pour détecter la perte du réflexe de pincement de l’orteil afin de confirmer une anesthésie adéquate. Placez la souris sur une bouillotte pour maintenir la température corporelle pendant la procédure.

Ensuite, appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour éviter la sécheresse. À l’aide de ciseaux fins, réalisez une incision longitudinale de 0,7 centimètre sur la peau de la région du bas du dos. Ensuite, écartez latéralement les extrémités légèrement ouvertes des ciseaux pour étendre doucement l’incision cutanée à environ 1,3 centimètre.

Ensuite, faites soigneusement une incision de 0,7 centimètre dans le péritoine pour exposer la cavité abdominale. Étendez l’incision péritonéale à 1,1 centimètre, en poussant bilatéralement avec des pointes de ciseaux légèrement ouvertes. Localisez le coussin adipeux relié à l’ovaire et tirez-le doucement vers l’extérieur à l’aide d’une pince jusqu’à ce que l’ovaire, l’oviduc et l’utérus soient exposés.

À l’aide d’une pince pour vaisseaux, sécurisez le coussin adipeux pour stabiliser les structures reproductrices. Ensuite, chargez deux microlitres du mélange d’injection de ribonucléoprotéines dans un capillaire plastique jetable à l’aide d’une pipetter-de-pochette. À l’aide de microciseaux, réalisez une incision de 0,2 centimètre dans la paroi de l’oviduc quelques millimètres en amont de l’ampoule.

Insérez le capillaire plastique fixé à la popotette décapante dans l’incision de l’oviduc et expulsez soigneusement le mélange d’injection sans introduire d’air. Retirez doucement le capillaire plastique de l’oviduc pour compléter l’injection. Allumez l’électroporateur en appuyant sur l’interrupteur d’alimentation du panneau avant.

Réglez les paramètres d’électroporation sur l’appareil comme affichés à l’écran. À l’aide d’électrodes de type pince, saisissez doucement l’oviduc et appuyez sur le bouton Kiloohm pour mesurer la résistance. Immédiatement après la mesure de la résistance, appuyez sur le bouton Start pour commencer l’électroporation et attendez que le signal final apparaisse sur le bouton Ohm.

Après l’électroporation du premier oviduc, il faut délicatement ramener le tube reproducteur dans la cavité abdominale. Fermez l’incision avec une suture chirurgicale à l’acide polyglycolique 4-0. Pour le génotypage, concevoir des amorces de 18 à 21 nucléotides avec une température de fusion proche de 60 degrés Celsius afin de générer un produit PCR de 300 à 600 paires de bases.

Pour confirmer la spécificité de chaque amorce, effectuez une recherche BLAST dans la base de données du génome de la souris afin d’éliminer le risque d’amplification non spécifique. Ensuite, pour l’extraction de l’ADN, à l’aide d’une perforation auriculaire, prélevez un petit échantillon de tissu d’environ deux millimètres de l’oreille de la souris. Ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse.

Incubez l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant 60 minutes, en tourbillonnant toutes les 20 minutes pour assurer une lyse efficace. Après avoir effectué le séquençage de Sanger, analysez les résultats pour évaluer les résultats de l’édition du génome. Pour utiliser l’analyse ICE, téléchargez les deux fichiers de séquençage de Sanger, entrez la séquence ARN guide, et sélectionnez la nucléase appropriée utilisée dans l’expérience CRISPR.

Ensuite, pour utiliser TIDE, téléchargez les fichiers de contrôle et de séquençage expérimental au format AB1 et entrez la séquence ARN guide. L’analyse ICE a détecté trois variants indel distincts au site de coupe Cas9 : une suppression d’une paire de bases dans 42 % des séquences, une suppression de trois paires de bases dans 25 % des séquences, et une suppression de 23 paires de bases dans 27 % des séquences. La valeur d’ajustement du modèle était de 0,94 et le score de knockout de 69, indiquant une forte corrélation prédite et un knockout génétique probable.

Les chromatogrammes séquentiels ont confirmé une perturbation au site de coupe Cas9 dans l’échantillon édité, tandis que le chromatogramme témoin montrait une séquence intacte au même site. Sur six souris électroporées, seulement quatre ont produit des petits avec mutations, ce qui a donné une efficacité d’édition globale de 60 %. Toutes les portées des six souris électroporées ont montré une diminution du nombre de petits, avec seulement trois à quatre petits par souris.