Name: Amélioration de la technologie des vésicules extracellulaires à récepteur d’antigène chimérique (CAR-EV) : l’avenir du traitement du cancer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Découvrez l'isolation optimisée des vésicules extracellulaires CAR pour le traitement du cancer. Cette méthode améliore l'efficacité des thérapies ciblées et permet la livraison d'ARN thérapeutiques contre les tumeurs solides.

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<ol><li>Park, J. H., Geyer, M. B., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+CAR+T-cell+therapeutics+for+hematologic+malignancies%3A+Interpreting+clinical+outcomes+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted CAR T-cell therapeutics for hematologic malignancies: Interpreting clinical outcomes to date.</a> Blood. 127 (26), 3312-3320 (2016).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td><solide>Matériaux</solide></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>Enrichissement des véhicules électriques</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium à 1 % (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771-100G</td><td>Dissoudre 1g de poudre SDS dans 10 mL d’eau ultrapure</td></tr><tr><td>1x solution saline tamponnée tris avec Tween-20 (TBST)</td><td>Produits chimiques Thermo Scientific</td><td>J77500. K2</td><td>Diluer avec de l’eau ultrapure pour obtenir une solution 1x (alternativement, préparer une solution de polysorbate-20/Tween-20 à 0,1 % dans une solution saline tamponnée 1x)</td></tr><tr><td>Microplaque en polystyrène transparent à fond plat 96 puits traitée TC, stérile</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>In vitro essai fonctionnel</td></tr><tr><td>Bolt Bis-Tris Plus Mini Gel Protéiné, 4-12 %, 1,0 mm, format WedgeWell</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Caractérisation des cellules/VE</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Caractérisation des cellules/VE</td></tr><tr><td>Anticorps anti-calnexine</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>LES 2433S</td><td>Caractérisation des cellules/VE</td></tr><tr><td>Cellules CAR-NK/T</td><td>ProMab Biotechnologies</td><td>Varie</td><td>Le domaine de liaison du ligand extracellulaire CAR dépend de la cible préférée des cellules receveuses</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Prolifération Test (MTS)</td><td>Promega</td><td>Réf. G3580</td><td>In vitro essai fonctionnel</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, sans EDTA Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Réactif de détection par transfert Western ECL</td><td>Amersham</td><td>RPN2232</td><td>Caractérisation des cellules/VE</td></tr><tr><td>Tampon d’élution</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Enrichissement/isolation des VE</td></tr><tr><td>Tampon d’équilibrage</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Enrichissement/isolation des VE</td></tr><tr><td>Colonne EXO-ACE IEX</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Enrichissement/isolement EV pour le dosage fonctionnel en aval Patent ID AU2024901931</td></tr><tr><td>Perles de capture pan-exosome EXO-NET</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Isolation EV pour la caractérisation en aval Patent ID : WO/2014/011673</td></tr><tr><td>Anticorps Granzyme B</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4275</td><td>Caractérisation des cellules/VE</td></tr><tr><td>IL-2 IS humain, qualité supérieure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td>Culture sans xénogramme de cellules T/NK</td></tr><tr><td>Piles de transfert iBlot 2, PVDF</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Caractérisation des cellules/VE</td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF (GMPc)</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>100-0956</td><td>Culture sans xénogramme de cellules T/NK</td></tr><tr><td>K-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>In vitro essai fonctionnel</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>In vitro essai fonctionnel</td></tr><tr><td>Millex-GP Unité de filtre à seringue, 0,22 & micro ; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td>Filtration terminale</td></tr><tr><td>Tampon de régénération</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Enrichissement/isolation des VE</td></tr><tr><td>Tampon RIPA (10X)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9806</td><td>Lyse cellulaire</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Évaluation de la viabilité et de la densité cellulaire</td></tr><tr><td>Tampon de lavage</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>Enrichissement/isolation des VE</td></tr><tr><td><fort>équipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé</td><td>Invitrogen</td><td>Comtesse II FL</td><td>Évaluation de la viabilité et de la densité cellulaire</td></tr><tr><td>Instrument d’extraction automatisé de paillasse</td><td>Invitrogen</td><td>Système Apex KingFisher</td><td>Système de purification automatisé à haut débit Voir le lien pour les détails du protocole : https://www.inoviq.com/site/technology/resources</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observateur 7</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)</td><td>Particle Metrix GmbH</td><td>Zetaview PMX-130</td><td>Analyse des particules</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTROstar Nano</td><td>In vitro essai fonctionnel</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse réfrigérée</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-15R</td><td>Culture cellulaire & Traitement de l’enrichissement des véhicules électriques</td></tr><tr><td>SDS-PAGE mini réservoir de gel</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td>Caractérisation des cellules/VE</td></tr><tr><td>Système de transfert par transfert Western</td><td>Invitrogen</td><td>iBlot 2</td><td>Caractérisation des cellules/VE</td></tr></tbody></table>

amélioration de la technologie des vésicules extracellulaires à récepteur d’antigène chimérique (car-ev) : l’avenir du traitement du cancer

Enhancing Chimeric Antigen Receptor-Extracellular Vesicles (CAR-EV) Technology: The Future of Cancer Therapy

La figure 1 illustre un flux de travail typique de culture de cellules CAR T/NK, suivi de l’isolement, de la caractérisation et de l’utilisation des VE dans un test fonctionnel. La MC provenant de la culture de cellules CAR T/NK est collectée avant l’enrichissement en VE et la caractérisation en aval (y compris l’analyse de suivi des nanoparticules) et l’activité fonctionnelle évaluée par un test MTS sur plaque multipuits (Figure 1).
Les cellules CAR-cellules marquées à la GFP peuvent être visualisées par microscopie pour confirmer l’expression de la construction CAR en culture. La microscopie doit être effectuée comme une étape de routine avant et pendant le prélèvement du MC pour assurer une efficacité de transduction suffisante. Il est important de superposer les canaux en fond clair et GFP pour capturer l’autofluorescence potentielle lors de l’évaluation de l’efficacité. Il convient de noter que les lymphocytes T ont tendance à s’agglutiner naturellement (similaire dans les cellules NK ; données non présentées), et la fluorescence peut être clairement observée lorsque les cellules présentent un phénotype aggloméré (Figure 2).
Après l’enrichissement en VE, les VE peuvent être caractérisés par NTA et immunoblot occidental. À l’aide du NTA, l’analyse du rendement en particules peut confirmer une concentration accrue dans les VE isolés, par rapport à la CM (Figure 3A). Les données du Western blot confirment en outre l’expression du marqueur cytolytique granzyme B dans les cellules CAR et les VE, et l’absence de calnexine dans ces dernières, ce qui confirme l’absence de matériel cellulaire dans les préparations. HEK293T cellules sont incluses en tant que contrôle CAR-négatif (Figure 3B).
L’analyse de la fonctionnalité des VE a été effectuée à l’aide d’un test MTS afin de déterminer la viabilité et la capacité de prolifération des cellules. L’effet de l’EGFR et des CAR-EV ciblant HER2 sur la viabilité et la croissance des cellules cancéreuses du sein MCF-7 et du cancer du sang K562 est déterminé par la mesure du réactif colorimétrique MTS à une absorbance de 490 nm (après élimination du signal de fond). Dans cet exemple, le ciblage de l’EGFR sur les CAR-EV a réduit la viabilité des cellules MCF-7 et K562 de 70 % et 40 %, respectivement. Le ciblage de HER-2 sur les CAR-EV a réduit le MCF-7 de ~10 % (tel que déterminé par le test t de Student). Compte tenu de la configuration expérimentale, l’utilisation d’un test non paramétrique (par exemple, Mann-Whitney U) pourrait offrir des informations plus robustes dans les études ultérieures (figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig1.jpg"> 
Figure 1 : Génération, enrichissement, caractérisation et lecture fonctionnelle des VE. Schéma de principe illustrant un flux de travail typique de génération, de production et de caractérisation d’échantillons de VE enrichis avant l’analyse de la fonctionnalité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig2.jpg"> 
Figure 2 : Analyse microscopique représentative par confirmation de l’expression de la GFP dans les cellules CAR-T ciblant HER2. Les images ont été capturées par microscopie à fluorescence, à l’aide d’un objectif 20x. La barre d’échelle blanche représente une longueur de 50 μm. Les lymphocytes T ont une tendance naturelle à se développer en amas avant de se détacher en cellules individuelles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig3.jpg"> 
Figure 3 : Caractérisation des cellules CAR et des VE. (A) Analyse des particules de nano-suivi des CAR CM et des VE enrichis. La concentration en particules des VE était de 1,6 à 2,1 fois supérieure à celle des CM, tandis que la concentration en protéines était réduite de &gt;80 %. Les différences statistiquement significatives ont été testées à l’aide de l’ANOVA à un facteur et du test de comparaison multiple de Tukey ; p≤ 0,001, **** p≤ 0,0001. (B) L’analyse par transfert Western de lymphocytes T transduits et de CAR-EV enrichis a confirmé la présence de granzyme cytolytique B dans les cellules CAR et les VE, alors qu’une absence a été notée dans HEK293T cellules non CAR. La calnexine n’a pas été détectée dans le CAR-EV, ce qui indique une faible contamination par les particules du réticulum endoplasmique. Charge protéique par voie = 5 μg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig4.jpg"> 
Figure 4 : Effet des CAR-EVs sur la viabilité des cellules cibles (cellules cancéreuses du sein MCF-7 et lignée cellulaire de leucémie myéloïde chronique K562). Les cellules cibles ont été traitées avec une dose unique de 4,5 x 105 et 2,5 x 105 EVs/cellule (EGFR ou HER2 CARs, respectivement) ou de contrôle (tampon EV) pendant une période allant jusqu’à 3 jours. (A) Cellules CAR-EVs ciblant l’EGFR. (B) CAR-EV ciblant HER2. Une diminution de l’absorbance (indicative de l’efficacité du traitement) a été observée dans les deux lignées cellulaires. Les données représentent l’absorbance moyenne ± l’écart-type (n = 3), analysée à l’aide d’un test t de Student bilatéral non apparié, les valeurs p indiquant la signification statistique ; ** p≤ 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Amélioration de la technologie des vésicules extracellulaires à récepteur d’antigène chimérique (CAR-EV) : l’avenir du traitement du cancer

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