Amélioration de la technologie des vésicules extracellulaires à récepteur d’antigène chimérique (CAR-EV) : l’avenir du traitement du cancer

Nos recherches portent sur le développement de diagnostics et de thérapies basés sur les exosomes. L’un des objectifs est de développer des thérapies basées sur des exosomes à récepteur antigénique chimérique, qui sont plus sûres, plus efficaces et plus accessibles que les thérapies cellulaires, pour le traitement des tumeurs secondaires. Nos plateformes EXO-NET et EXO-ACE permettent une isolation d’exosomes évolutives, reproductibles et conformes aux BPF avec un rendement et une pureté élevés, remédiant ainsi aux limites des méthodes traditionnelles de recherche et de thérapie.

EXO_NET net et EXO-ACE permettent une isolation rapide, évolutive et conforme aux BPF des VE, avec une pureté et une reproductibilité supérieures, surpassant la centrifugation et la précipitation pour la recherche, le diagnostic et les applications thérapeutiques. Nous avons mis au point une méthode rapide, évolutive et validée pour concevoir des CAR-EV et fournir des thérapies ciblées sans cellules de nouvelle génération. Cela fournit un flux de travail robuste qui peut être appliqué à d’autres maladies où il existe un besoin clinique.

Notre prochain objectif est d’utiliser les méthodes que nous avons développées et validées pour générer des CAR-EV pour l’administration de thérapies à base d’ARN pour le traitement des tumeurs solides et d’autres maladies inflammatoires. Pour commencer, amenez la colonne d’échange d’ions à température ambiante en la laissant se tenir debout pendant 15 minutes. À l’aide d’une pipette, ajoutez 10 volumes de colonne de tampon de régénération, suivis de 10 volumes de colonne de tampon d’équilibration.

Faites passer le milieu conditionné THOD à travers un filtre en polyéthersulfone de 0,22 micromètre. Maintenant, ajoutez jusqu’à 31,2 volumes de colonne de l’échantillon filtré dans la colonne équilibrée. Ajoutez ensuite 10 volumes de colonne de tampon de lavage, suivis de 2,5 volumes de colonne de tampon d’élution.

Collectez le flux à travers le contenant les vésicules extracellulaires enrichies. À l’aide de filtres centrifuges d’ultrafiltration de 30 kilodaltons et d’un diluant, effectuer un échange de tampon sur l’élué de la vésicule extracellulaire, en assurant une dilution minimale de 100 fois. Ajustez le volume final de la solution remplacée en fonction des besoins expérimentaux.

Faites passer l’échantillon de vésicule extracellulaire enrichi à travers un filtre de 0,22 micromètre pour le stériliser pour des tests in vitro. Déterminez la distribution de la taille, la concentration et le rendement des vésicules extracellulaires CAR à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules. Pour l’isolement des vésicules extracellulaires pan-exosomes à haut débit, allumez et connectez-vous à l’instrument.

Configurez les paramètres pour établir le protocole d’isolement de la protéine HT EV. Préparez une plaque de peigne à pointes en plaçant un peigne à pointes dans une plaque à puits profonds de 96 puits. Ajoutez un millilitre de PBS dans chaque puits pour préparer trois plaques de lavage.

Maintenant, préparez une plaque d’élution en pipetant 35 microlitres de tampon SDS à 1 % dans chaque puits d’une plaque à 96 puits. Préparez ensuite une plaque de reliure en ajoutant un millilitre de milieu conditionné. Sur le système d’isolement automatisé, commencez le protocole en sélectionnant le programme HT EV Protein Isolation Protocol, puis sélectionnez le bouton de lecture.

Ouvrez l’instrument pour commencer à charger les plaques. Suivez les instructions de l’instrument et chargez les plaques d’élution préparées, puis les plaques à trois lavages dans l’instrument. Juste avant de charger la plaque de liaison, ajoutez 30 microlitres de billes de capture de pan-exosome dans chaque puits.

Chargez la plaque de reliure dans l’instrument, puis chargez la plaque du peigne de pointe et fermez l’instrument pour lancer la liaison. Le système mélangera l’échantillon de milieu conditionné et les billes magnétiques en continu à basse vitesse pendant 30 minutes, facilitant ainsi la capture efficace des vésicules extracellulaires. Une fois l’étape de liaison terminée, laissez le système effectuer trois étapes de lavage, en mélangeant à vitesse lente pendant 30 secondes pour éliminer les contaminants non spécifiques.

Permettez au système automatisé d’initier la lyse des vésicules extracellulaires pour la récupération des protéines en effectuant un mélange de fond de 30 secondes. Pendant l’incubation, l’instrument fera une pause de sept minutes et 30 secondes, tout en maintenant les pointes de la pipette positionnées au-dessus de chaque puits. Lancez un autre mixage de 30 = secondes, suivi d’une autre pause de sept minutes et 30 secondes.

À la fin du protocole, le système soulève le peigne de pointe utilisé, laissant la solution dans la plaque à 96 puits et les billes magnétiques attachées aux pointes. Enfin, l’instrument passera à l’étape de congé, en ramenant le peigne de pointe dans la plaque du peigne de pointe. Ouvrez l’instrument et retirez les plaques.

La fluorescence GFP a confirmé l’expression de CAR dans les lymphocytes T transduits, avec une localisation évidente dans les amas de cellules et une colocalisation vérifiée en superposant les canaux en fond clair et GFP. L’analyse du suivi des nanoparticules a révélé une concentration significativement plus élevée de vésicules extracellulaires dans la fraction EV enrichie par rapport aux milieux conditionnés pour les constructions EGFR et HER2 CAR. Le western blot a confirmé la présence de granzyme B dans les cellules exprimant le CAR et dans les vésicules extracellulaires isolées, la calnexine étant absente dans les vésicules extracellulaires, indiquant l’absence de contamination cellulaire.

Les vésicules extracellulaires CAR ciblant l’EGFR ont significativement réduit la viabilité des cellules cancéreuses du sein MCF-7 de 70 % et la viabilité des cellules cancéreuses du sang K-562 de 40 % Les vésicules extracellulaires CAR-ciblant HER2 ont montré une réduction d’environ 10 % de la viabilité des cellules cancéreuses du sein MCF-7, tout en n’ayant aucun effet observable sur les cellules cancéreuses du sang K-562.