Reprogrammation in vivo de cellules tumorales en cellules dendritiques conventionnelles de type 1

Nous étudions la programmation in vivo des cellules cancéreuses en cellules de type cDC1 en tant que nouvelle stratégie d’immunothérapie. Nous visons à déterminer si cette approche peut convertir les tumeurs immunitaires froides en tumeurs immunitaires chaudes, annonçant ainsi une immunité anti-tumorale. Nous abordons les limites des stratégies actuelles de génération de cDC1 in vivo en présentant un protocole pour convertir les cellules cancéreuses en cellules immunogènes de type cDC1 directement dans la tumeur, permettant ainsi d’étudier les réponses immunitaires induites par les cDC1 in situ.

Notre protocole de programmation in vivo permet de générer de manière fiable des cellules immunogènes matures de type cDC1, surmontant le microenvironnement tumoral suppressif, et parce que ces cellules sont générées directement in vivo, cette approche élimine le besoin de fabrication de cellules immunitaires in vitro. Nos résultats établissent une base pour l’application clinique de la reprogrammation médiée par le facteur de transcription in vivo, en introduisant une immunothérapie anticancéreuse prête à l’emploi, mais personnalisée, qui suscite des réponses immunitaires antitumorales durables. À l’avenir, nous étudions comment la reprogrammation des cellules de type cDC1 peut provoquer la formation de tertiaire et d’infrastructure et si cela se traduit par une immunité humorale.

De plus, nous explorons également sa synergie potentielle avec d’autres approches immunothérapeutiques. Pour commencer, cultivez les cellules HEK 293T jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 à 80 % de confluence. Maintenant, vortex le mélange de transfection préparé contenant le plasmide de transfert à fond pendant une minute et incubez le mélange pendant 15 minutes à température ambiante pour permettre la formation du complexe lipidique de l’ADN.

Aspirez le milieu des cellules HEK 293T et ajoutez 10 millilitres de DMEM sans pénicilline streptomycine et complété par 10 % de FBS. Ensuite, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte aux plaques de 150 millimètres et incubez pendant 16 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, remplacez le milieu par 20 millilitres de milieu complet DMEM complété par un butyrate de sodium millimolaire, et incubez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, prélever le surnageant contenant du lentivirus dans un tube conique de 50 millilitres à 48 et 60 heures après la transfection. Après la première récolte, ajoutez 12 millilitres de DMEM complet préchauffé par plaque de 150 millimètres pour la deuxième récolte. Filtrez le liquide collecté à travers un filtre en polyéthersulfone de 0,45 micromètre, à faible liaison protéique.

Pipeter 37 grammes de milieu contenant du lentivirus dans des tubes en polypropylène à paroi mince ouverts de 38,5 millilitres. Centrifuger les tubes dans un rotor à godets oscillants à 25 000 G pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, aspirer le surnageant sans perturber la pastille.

Placez les tubes en polypropylène à paroi mince à dessus ouvert à l’envers sur une lingette de laboratoire ou un matériau absorbant similaire pendant cinq minutes pour égoutter l’excès de liquide et sécher la pastille. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de DMEM glacé complété par de l’HEPES ou du PBS à chaque granulé et transférez le mélange dans un tube de microcentrifugation placé dans un tube conique de 50 millilitres. Incuber la pastille pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre une remise en suspension complète.

Combinez toutes les pastilles remises en suspension dans un seul récipient, aliquotez le stock viral en petits volumes entre 50 et 200 microlitres et stockez-le à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation à long terme. Après l’expansion des cellules cancéreuses, préparez les suspensions cellulaires pour la transduction afin d’obtenir un rapport proche de un pour un entre les cellules positives à l’EGFP et les cellules négatives à l’EGFP le troisième jour. Ajouter huit microgrammes par millilitre de polybrène à la suspension cellulaire, suivi du volume approprié de lentivirus, comme déterminé précédemment.

Mélangez doucement le contenu sans générer de bulles. Maintenant, pipetez deux millilitres de la suspension cellulaire préparée contenant un fois 10 à la puissance cinq cellules dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits et incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après 24 heures, retirez le milieu contenant du lentivirus de chaque puits.

Lavez les puits deux fois avec du PBS. Ajoutez 500 microlitres de trypsine dans chaque puits et incubez pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, examinez les puits au microscope optique pour confirmer le détachement complet de la cellule de la plaque.

Ensuite, collectez les cellules à l’aide d’un milieu complet dans des tubes coniques de 50 millilitres. Centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 350 G pour les granuler. Lavez le granulé avec du PBS.

Prenez une aliquote et évaluez le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration au bleu de trypan. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire finale dans du PBS glacé pour atteindre une concentration de deux à quatre fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre, correspondant à une à deux fois 10 à la puissance six cellules dans 50 microlitres par tumeur. Placez les cellules sur de la glace et déplacez-les dans la zone d’expérimentation animale.

Après avoir anesthésié la souris CD45.1, placez-la sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Appliquez une crème pour les yeux sur la souris pour prévenir la déshydratation oculaire pendant l’anesthésie. À l’aide d’un rasoir, rasez le flanc droit de la souris.

Si vous le souhaitez, marquez la souris à l’aide d’une tondeuse à oreilles. Désinfectez la zone rasée et enlevez les poils restants avec un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 %. Maintenant, à l’aide d’une pipette P1000, remettez complètement les cellules cancéreuses en suspension.

Chargez la suspension à cellules entièrement remise en suspension dans une seringue de 0,5 millilitre équipée d’une aiguille de calibre 30. Soulevez doucement la peau sur le flanc rasé de la souris à l’aide de deux doigts et insérez la pointe de l’aiguille de la seringue dans le pli formé par la peau soulevée. Relâchez la peau liftée tout en maintenant la seringue en place d’une main.

Utilisez l’autre main pour étirer le haut de la peau avec deux doigts. Injectez lentement 50 microlitres de suspension de cellules cancéreuses pour créer un gonflement sous-cutané visible de forme ovale au site d’injection. Après la procédure d’injection, surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il se réveille complètement de l’anesthésie pour assurer sa survie.

Les cellules HEK 293T transfectées avec le plasmide SFFV-PIB-eGFP ont montré une expression claire de l’eGFP 24 heures après la transfection, confirmant une administration réussie du plasma. 72 heures après la transduction, les cellules de mélanome ont indiqué une administration réussie des facteurs de reprogrammation et de l’eGFP. Le neuvième jour après l’implantation des cellules, la reprogrammation in vivo a donné un pourcentage plus élevé de cellules CD45-positives, MHC-II-positives et de type cDC1 entièrement reprogrammées qu’in vitro.

Le troisième jour après l’implantation, les tumeurs PIB-eGFP ont montré une infiltration de cellules immunitaires CD45 positives nettement plus élevée que les témoins eGFP, indiquant un remodelage immunitaire précoce. Au neuvième jour, l’intensité moyenne de fluorescence CD45 par zone tumorale restait significativement plus élevée dans les tumeurs PIB-eGFP que dans les témoins. Les structures lymphoïdes tertiaires sont devenues détectables dans les tumeurs PIB-eGFP au neuvième jour, indiquant des changements immunitaires structurels dans le microenvironnement tumoral.