Name: Reprogrammation in vivo de cellules tumorales en cellules dendritiques conventionnelles de type 1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Découvrez la reprogrammation in vivo de cellules tumorales en cellules dendritiques cDC1 pour l'immunothérapie anticancéreuse chez la souris. Cette méthode transforme les tumeurs froides en tumeurs chaudes et stimule l'immunité antitumorale durable.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Oliveira, G., Wu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+specificities+of+T+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).</li>
<li>Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-year+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).</li>
<li>Adams, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+monotherapy+for+previously+untreated%2C+PD-L1-positive%2C+metastatic+triple-negative+breast+cancer%3A+cohort+B+of+the+phase+II+KEYNOTE-086+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study.</a> Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).</li>
<li>Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+trial+of+trifluridine%2Ftipiracil+plus+nivolumab+in+patients+with+heavily+pretreated+microsatellite-stable+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).</li>
<li>Reardon, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+phase+3+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+nivolumab+vs+bevacizumab+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%3A+CheckMate+143%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143.</a> Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+as+orchestrators+of+anticancer+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).</li>
<li>Heras-Murillo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+with+conventional+type-1+dendritic+cells+induces+immune+memory+and+limits+tumor+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse.</a> Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).</li>
<li>Theisen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WDFY4+is+required+for+cross-presentation+in+response+to+viral+and+tumor+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens.</a> Science. 362 (6415), 694-699 (2018).</li>
<li>Meiser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+stimulatory+cDC1+subpopulation+amplifies+CD8%2B+T+cell+responses+in+tumors+for+protective+anti-cancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity.</a> Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).</li>
<li>Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-residing+Batf3+dendritic+cells+are+required+for+effector+T+cell+trafficking+and+adoptive+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy.</a> Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).</li>
<li>Hubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-III+is+selectively+produced+by+cDC1+and+predicts+good+clinical+outcome+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer.</a> Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).</li>
<li>Mahadevan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+conventional+dendritic+cells+facilitate+immunotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer.</a> Science. 384 (6703), eadh4567(2024).</li>
<li>Ascic, E., Pereira, C. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).</li>
<li>Silk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+tumour+antigens+by+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+CD141%2B+XCR1%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells.</a> Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).</li>
<li>Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+generation+of+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and generation of human dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).</li>
<li>Makino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cDC-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).</li>
<li>Balan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+human+dendritic+cell+differentiation+revealing+Notch-dependent+lineage+bifurcation+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity.</a> Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).</li>
<li>Ascic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+cell+reprogramming+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy.</a> Science. 386 (6719), eadn9083(2024).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+antigen-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+informs+efficient+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+cross-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).</li>
<li>Zimmermannova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+tumor+immunogenicity+with+dendritic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming.</a> Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).</li>
<li>Bouquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RapaCaspase-9-based+suicide+gene+applied+to+the+safety+of+IL-1RAP+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells.</a> Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+primary+human+fibroblasts+with+only+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).</li>
<li>Rojas, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+RNA+neoantigen+vaccines+stimulate+T+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer.</a> Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).</li>
<li>Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cancer+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells.</a> Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).</li>
<li>Cabrita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+lymphoid+structures+improve+immunotherapy+and+survival+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma.</a> Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).</li>
<li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+endogenous+retroviruses+promote+lung+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy.</a> Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu ; Filtre à faible teneur en protéines, filtre à vide de 150 ml</td><td>Fisher scientifique</td><td>15983297</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD45 anti-souris (clone : 30-F11), IgG2b de rat, &kappa ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>N° B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)</td><td>Le Laboratoire Jackson</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>Seringues à insuline BD Micro-Fine U-100 (0,5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11395751</td><td></td></tr><tr><td>Souris C57BL/6J</td><td>Le Laboratoire Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules Corning Falcon pour une utilisation avec des tubes coniques de 50 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS352340</td><td></td></tr><tr><td>Verres de protection Corning 24 x 50 mm&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de viabilité fixable eBioscience eFluor 450</td><td>Invitrogen</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Solution de récupération d’antigène IHC eBioscience - pH faible (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4955-58</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage Fluoromount-G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GFP [Alexa Fluor 594]</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-308AF594</td><td></td></tr><tr><td>Mélange Gibco DMEM/Nutriments F-12 (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Moyen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-rat IgG (H+L) de chèvre adsorbé croisé, polyclonal, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HEK 293T</td><td>CIFA</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N° H9268</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec une teneur élevée en glucose</td><td>Cytiva</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Pénicilline Streptomycine 100x Solution (Pen/Streptocoque)</td><td>Cytiva</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate HyClone (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol vet. Solution injectable 100 mg/mL</td><td>MSD Santé animale Suède</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>Lame Microtome - C35</td><td>PFM médical</td><td>207500005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2 pour souris (104), Surface, APC, Monoclonal</td><td>Biolégende</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHCII de souris (M5/114.15.2), Surface, PE-Cy7, Monoclonal</td><td>Biolégende</td><td>107630</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de rat normal (stérile)</td><td>Abcam</td><td>AB7488</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène à paroi mince à toit ouvert</td><td>Beckman Coulter Sciences de la vie</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, 16 % p/v aq. soln., sans méthanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>043368.9M</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Batf3, une souris monocistronique codant pour cassette Batf3</td><td>Addgene</td><td>139837</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Irf8, une souris monocistronique codant une cassette Irf8</td><td>Addgene</td><td>139838</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Pu.1, une souris monocistronique codant une cassette Pu.1</td><td>Addgene</td><td>139839</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide SFFV-eGFP (eGFP)</td><td>Clonage en interne</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide SFFV-mCherry (mCherry)</td><td>Clonage en interne</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide SFFV-PIB-eGFP,&nbsp ; une cassette polycistronique codant une souris PU.1, IRF8 et BATF3 (PIB)&nbsp ;</td><td>Clonage en interne</td><td>-</td><td>Les constructions et les vecteurs utilisés pour la reprogrammation sont disponibles auprès d’Asgard Therapeutics dans le cadre d’un accord de transfert de matériel avec la société</td></tr><tr><td>Polyéthylénimine (PEI), linéaire, MW 25000, qualité transfection</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>ReadyProbes Stylo Pap barrière hydrophobe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R3777</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Butyrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope à adhérence SuperFrost Plus</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Composé Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x) sans rouge de phénol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>TT Cryomold Intermédiaire, carré (15 x 15 x 5 mm)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Xysol vet. Solution injectable 20 mg/mL</td><td>VM Pharma</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr><tr><td>MIAMM1.7 cellules</td><td>Antineo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reprogrammation in vivo de cellules tumorales en cellules dendritiques conventionnelles de type 1

Tractable In Vivo Reprogramming of Tumor Cells to Type 1 Conventional Dendritic Cell-like Cells

Une vue d’ensemble schématique du protocole de reprogrammation in vivo tractable est présentée à la figure 1. Tout d’abord, nous avons produit le vecteur lentiviral polycistronique SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), codant pour les facteurs de reprogrammation CP1 PU.1, IRF8, BATF3, suivis d’un site d’entrée ribosomique interne (IRES) et d’une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) dans la lignée cellulaire d’emballage HEK 293T. Pour contrôler l’immunogénicité médiée par le lentivirus, nous avons produit un vecteur SFFV-MCS-eGFP (eGFP) vide, contenant un site de clonage multiple (MCS) et IRES-eGFP, mais excluant les facteurs de reprogrammation. Suite à la production virale, nous avons récolté le surnageant contenant du lentivirus et l’avons concentré par ultracentrifugation. Nous avons titré fonctionnellement le virus pour déterminer la quantité nécessaire pour obtenir un rapport de 1:1 entre les cellules transduites (eGFP+) et les cellules non transduites (eGFP-), que nous avons évalué le 3e jour après la transduction. Ensuite, nous avons utilisé la quantité de virus résultante pour transduire la lignée cellulaire cancéreuse sélectionnée au jour -1. Après 24 h, nous avons collecté les cellules et les avons implantées par voie sous-cutanée pour établir des tumeurs. Cette stratégie a permis de s’assurer que les cellules transduites se reprogrammaient en cellules de type cDC1 in vivo, au sein du TME. À des moments précis après la greffe, nous avons excisé et traité des tumeurs pour des analyses en aval, y compris la cytométrie en flux des cellules tumorales dissociées, afin de quantifier l’efficacité de la reprogrammation in vivo, ou la coloration par immunofluorescence de sections tumorales cryopréservées pour caractériser les changements dans le TME.
Tout d’abord, pour assurer la production de titres lentiviraux élevés, nous avons surveillé les cellules HEK 293T avant la transfection, en visant à atteindre une confluence de 70-80 % et 24 h plus tard, nous avons évalué l’efficacité de la transfection par expression eGFP par microscopie à fluorescence (Figure 2A). Ensuite, nous avons collecté un milieu contenant le virus 48 h et 60 h après la transfection, l’avons ultracentrifugé et stocké dans des aliquotes à -80 °C (Figure 2B). Ensuite, nous avons déterminé la quantité virale optimale nécessaire pour obtenir un rapport de 1:1 entre les cellules eGFP+ et eGFP- dans les cellules de mélanome YUMM1.7. Nous avons ensemencé 10 cellulesde 5 YUMM1.7 par puits dans une plaque de 6 puits, transduit les cellules avec des volumes croissants de lentivirus et remplaçons le surnageant contenant le virus par un milieu complet DMEM/F12 frais après 24 h (Figure 2C). Le jour 3, nous avons évalué l’expression de l’eGFP par microscopie à fluorescence, avant de procéder à la quantification des pourcentages précis de cellules eGFP+ par cytométrie en flux (Figure 2C). Pour quantifier le rapport entre les cellules eGFP+ et les cellules eGFP- , nous avons utilisé des cellules uniques vivantes pour exclure les cellules mortes et les doublets (Figure 2D). Le volume optimal du lot de lentivirus produit a été déterminé à la fois pour le PIB-eGFP et le virus témoin eGFP à 2 μL par 10 cellules5 YUMM1.7, ce qui a donné 50,0 ± 0,3 % et 63,0 ± 0,9 % de cellules eGFP+ , respectivement (figure 2E).
Ensuite, pour évaluer l’efficacité de la reprogrammation in vivo, nous avons généré une lignée cellulaire cancéreuse marquée par fluorescence (mCherry+) (YUMM1.7-mCherry). Cela nous a permis de faire la distinction entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales ou immunitaires en intégrant des cellules mCherry+ vivantes dans l’analyse par cytométrie en flux (Figure 3A,B). Nous avons ensuite transduit des cellules YUMM1.7-mCherry avec 2 μL de PIB-eGFP ou le virus témoin eGFP par 10à 5 cellules pour obtenir un rapport eGFP+ à eGFP- de 1:1. Nous avons implanté par voie sous-cutanée 1,6 × 106 cellules par tumeur chez des souris CD45.1 et conservé une aliquote de cellules à cultiver in vitro à des fins de comparaison. Nous avons évalué l’efficacité de la reprogrammation par cytométrie en flux, en contrôlant les cellules vivantes mCherry+ eGFP+ et CD45.1- pour exclure les cellules immunitaires de l’hôte qui ont englouti eGFP ou mCherry (Figure 3B). Du 1er au 9e jour, nous avons observé l’acquisition progressive de l’expression de CD45.2 et/ou du CMH-II, marquant les cellules de type cDC1 partiellement reprogrammées (CD45.2+ MHC-II- ou CD45.2- MHC-II+) et les cellules de type cDC1 entièrement reprogrammées (CD45+ MHC-II+) (Figure 3C). Nous avons validé que la reprogrammation des cellules cancéreuses de souris in vivo entraînait des pourcentages plus élevés de cellules de type cDC1 au jour 9 par rapport aux conditions in vitro (9,54 ± 1,54 % CD45+ MHC-II+ in vivo vs 4,72 ± 1,1 % CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,018). La cinétique de reprogrammation a également été accélérée puisque nous avons observé un pourcentage plus élevé de cellules de type cDC1 dès le jour 4 (8,7 ± 3,3 % de CD45+ MHC-II+ in vivo vs 0,3 ± 0,1 % de CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,05), indiquant que la présence de signaux environnementaux favorise une reprogrammation plus rapide et plus efficace vers les cellules de type cDC119. Alors que des cellules de type cDC1 reprogrammées in vitro étaient présentes jusqu’au 15e jour, les cellules de type cDC1 in vivo ont persisté pendant 9 jours, mais n’ont pas été détectées au 15e jour, ce qui suggère une appauvrissement du TME par le système immunitaire de l’hôte (Figure 3C). 
Enfin, nous avons cherché à caractériser les changements précoces du TME à la suite de la reprogrammation in vivo de cDC1 dans les 9 premiers jours. Nous avons effectué une coloration par immunofluorescence de tissus tumoraux cryoconservés et sectionnés de tumeurs eGFP et PIB-eGFP après 3 et 9 jours de reprogrammation in vivo , en nous concentrant sur l’infiltration des cellules immunitaires marquées par le marqueur pan-hématopoïétique CD45. Notamment, les cellules de type cDC1 ont recruté significativement plus de cellules CD45 dans le TME facilement au jour 3, par rapport aux tumeurs eGFP (49,6 ± 17,0 vs 8,0 ± 5,8 eGFP intensité moyenne de fluorescence de la coloration CD45 par zone tumorale ; Figures 4A, B). Il est intéressant de noter que nous avons détecté TLS dans le TME des tumeurs après 9 jours de reprogrammation in vivo . Cela suggère que les cellules de type cDC1 peuvent rapidement remodeler le TME d’un environnement « immunitaire-froid » à un environnement « immunitaire-chaud » en 3 jours, ce qui conduit ensuite à la formation de TLS le 9e jour.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig1.jpg"> 
Figure 1 : Présentation du protocole pour générer des cellules de type cDC1 par reprogrammation in vivo de cellules cancéreuses. Les vecteurs lentiviraux SFFV-PIB-IRES-eGFP codant pour PU.1, IRF8 et BATF3 dans une cassette polycistronique sous le contrôle du promoteur du virus formant le foyer de la rate (SFFV) et de l’eGFP après un site d’entrée interne du ribosome (IRES) pour suivre les cellules transduites par cytométrie en flux et microscopie à fluorescence - sont produits dans la lignée cellulaire d’emballage HEK 293T. Ensuite, les vecteurs lentiviraux sont ultracentrifugés et titrés fonctionnellement pour déterminer la quantité de virus nécessaire à la transduction des cellules cancéreuses dans un rapport de 1:1 entre les cellules eGFP+ transduites et les cellules eGFP- non transduites. Pour les expériences de reprogrammation in vivo, les cellules cancéreuses reçoivent la quantité optimale de lentivirus au jour -1. Le lendemain, ce mélange 1:1 de cellules GFP+ transduites et de cellules GFP- non transduites est lavé et collecté pour l’établissement de tumeurs sous-cutanées chez la souris. Des cultures in vitro parallèles sont maintenues pour valider la transduction au jour 3 par cytométrie en flux. Les animaux sont surveillés tous les 2-3 jours pour la croissance tumorale et la survie. Les tumeurs sont collectées à des moments définis, dissociées et colorées pour l’expression de marqueurs de surface pour l’analyse par cytométrie en flux. Alternativement, des tissus entiers sont fixés, cryoconservés et sectionnés pour la coloration par immunofluorescence et l’analyse par microscopie confocale. L’efficacité de la reprogrammation in vivo est évaluée par analyse par cytométrie en flux, tandis que les modifications du microenvironnement tumoral sont caractérisées par l’imagerie confocale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig2.jpg"> 
Figure 2 : Production et titrage fonctionnel de lentivirus pour la reprogrammation in vivo de cDC1. (A) Lorsque les cellules HEK 293T atteignent une confluence de ~70-80 %, elles sont transfectées avec un mélange contenant 10 μg de plasmide de transfert SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) ou un contrôle de vecteur lentiviral vide SFFV-eGFP (eGFP), ainsi que 7,5 μg de psPAX2, 2,5 μg de mPD2.G et 60 μL de 1 mg/mL d’EPI. Images de microscopie à fond clair et à fluorescence des cellules HEK 293T montrant l’expression de l’eGFP 24 h après la transfection, indiquant une administration réussie du plasmide. Barres d’échelle = 200 μm. (B) Représentation schématique du flux de travail d’ultracentrifugation pour concentrer le lentivirus. Le surnageant contenant du lentivirus des cellules HEK 293T est prélevé 48 h et 60 h après la transfection, filtré à travers un filtre PES à faible liaison protéique de 0,45 μm, et 37 g sont pesés dans des tubes en polypropylène à paroi mince ouverts à l’aide d’une balance de laboratoire. Les tubes sont ultracentrifugés dans un rotor à godets oscillants, le surnageant est aspiré et les granulés sont séchés pendant 5 min. Les granulés sont ensuite remis en suspension dans du DMEM glacé contenant HEPES et incubés pendant la nuit avant d’être aliquotés et stockés à -80 °C. (C) Stratégie expérimentale du titrage fonctionnel pour déterminer la dose virale optimale permettant d’obtenir un rapport de 1:1 entre les cellules GFP+ et GFP-. Images de microscopie à fond clair et à fluorescence montrant l’expression de l’eGFP dans les cellules de mélanome YUMM1.7, 72 h après la transduction, indiquant une administration réussie des facteurs de reprogrammation et de l’eGFP. Barres d’échelle = 100 μm. (D) Graphiques de cytométrie en flux représentatifs montrant la stratégie de contrôle pour quantifier le rapport des cellules eGFP+. Les cellules vivantes ont été contrôlées pour la viabilité de la population négative aux colorants (DAPI), suivie de l’exclusion des doublets. (E) Quantification par cytométrie en flux de l’efficacité de la transduction avec des doses virales croissantes afin de déterminer le volume optimal pour obtenir des cellules GFP+/GFP- 1:1. Pour les lentivirus PIB-eGFP et eGFP, un volume de 2 μL par 10à 5 cellules a atteint le rapport souhaité. Abréviations : cDC1s = cellules dendritiques conventionnelles de type 1 ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; PIB = PU.1, IRF8 et BATF3 ; PEI = polyéthylénimine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig3.jpg"> 
Figure 3 : Évaluation de l’efficacité de reprogrammation in vivo de cDC1. (A) Représentation schématique du flux de travail expérimental pour évaluer l’efficacité de reprogrammation in vivo de cDC1. Les cellules cancéreuses sont d’abord transduites avec un lentivirus exprimant mCherry pour générer une lignée cellulaire marquée par fluorescence (YUMM1.7-mCherry), suivie d’une transduction avec la dose optimisée de lentivirus PIB-eGFP le jour -1. Les cellules sont ensuite injectées par voie sous-cutanée avec un rapport de 1:1 de cellules eGFP+/eGFP- le jour 0 pour établir des tumeurs chez les souris CD45.1 et permettre aux cellules transduites par PIB de se reprogrammer en cellules de type cDC1 au sein du TME. Les tumeurs sont ensuite isolées à des moments indiqués, dissociées et colorées pour CD45.1, CD45.2 et CMH-II à l’aide de la cytométrie en flux. Cela permet d’exclure les cellules immunitaires de l’hôte CD45.1 pour quantifier l’efficacité de reprogrammation in vivo de cDC1 par l’expression de CD45.2 et du CMH-II. Des cultures in vitro parallèles sont conservées tout au long des points temporels à titre de comparaison avec la reprogrammation in vivo. (B) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux illustrant la stratégie de déclenchement au jour 9. Les cellules ont été contrôlées sur mCherry+ et GFP+ pour identifier les cellules cancéreuses transduites avec succès. Les cellules immunitaires de l’hôte ont été exclues en excluant les cellules CD45.1+. (C) Quantification de l’efficacité de reprogrammation in vivo (à gauche) des cellules YUMM1.7-mCherry par cytométrie en flux en pourcentage de cellules CD45+ MHC-II+ (complètement reprogrammées) et de cellules CD45.2+ HLA-DR- ou CD45.2- HLA-DR+ cDC1-like (partiellement reprogrammées) contrôlées au sein d’eGFP+ mCherry+ Cellules. Graphiques représentatifs de cytométrie en flux (à droite) montrant l’acquisition progressive de l’expression de CD45.2 et du CMH-II dans les cellules YUMM1.7-mCherry transduites par PIB-eGFP aux points de temps indiqués. Des cellules YUMM1.7-mCherry transduites par eGFP ont été utilisées comme contrôle et des cellules de type cDC1 reprogrammées in vitro ont été utilisées à des fins de comparaison. Les données en (C) indiquent la moyenne ± ET de 3 à 5 expériences de réplication biologique. L’analyse statistique en (C) a été effectuée pour les cellules CD45+ du CMH-II+ à l’aide du test de Mann-Whitney. *P &lt; 0,05. Abréviations : cDC1s = cellules dendritiques conventionnelles de type 1 ; PIB = PU.1, IRF8 et BATF3 ; TME = microenvironnement tumoral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig4.jpg"> 
Figure 4 : Analyse de l’infiltration immunitaire dans le microenvironnement tumoral suite à la reprogrammation in vivo de cDC1. (A) Des images confocales représentatives montrant des cellules CD45+ dans les tumeurs YUMM1.7 après implantation sous-cutanée de cellules PIB-eGFP- ou de cellules témoins transduites eGFP (rapport 1:1 entre les cellules transduites et les cellules parentales) aux jours 3 et 9. Barres d’échelle = 500 μm. (B) Quantification de l’IMF pour la coloration CD45 dans les tumeurs YUMM1.7 traitées par PIB et témoins transduites par eGFP aux jours 3 et 9. Les données de la partie (B) indiquent l’écart-type moyen ± de 3 à 6 expériences de répétitions biologiques. L’analyse statistique en (B) a été effectuée à l’aide du test de Mann-Whitney. *P &lt; 0,05 et ***P &lt; 0,001. Abréviations : cDC1s = cellules dendritiques conventionnelles de type 1 ; PIB = PU.1, IRF8 et BATF3 ; MFI = intensité moyenne de fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Reprogrammation in vivo de cellules tumorales en cellules dendritiques conventionnelles de type 1

The efficacy of cancer immunotherapy relies on the recruitment and activation of cytotoxic T cell responses against solid tumors by type 1 conventional ...

tractable-vivo-reprogramming-tumor-cells-to-type-1-conventional

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Génération des lymphocytes T à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) donne une approche alternative de l'utilisation de cellules souches embryonnaires à des cellules T à base d'immunothérapie. Procédé montre que, en utilisant...

Différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à l&#39;égard des lymphocytes T

Cette vidéo présente une technique de génération ex vivo de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifique de l’antigène tumoral. Des vecteurs rétroviraux porteurs d’ARN transgénique sont mélangés à des cellules de la rate dans un milieu complété par de l’interleukine-2 pour favoriser la survie et la prolifération des lymphocytes T. Le mélange est ensuite transféré sur une plaque recouverte de fragments de fibronectine humaine recombinante et centrifugée pour faciliter la...

Une technique ex vivo pour générer des lymphocytes T récepteurs antigéniques chimériques spécifiques à une tumeur

La méthode la plus couramment utilisée pour générer un grand nombre de cellules dendritiques autologues (CD) pour l'utilisation dans l'immunothérapie tumorale est décrite. La méthode utilise IL-4 et GM-CSF pour différencier les PED à partir de monocytes. Les DC immatures sont stimulées à maturité, puis chargé avec des antigènes avant qu'ils ne soient réinjectées au patient.

Préparation de la tumeur cellules dendritiques matures antigène chargées pour l&#39;immunothérapie

Évalué chez des hôtes immunocompétents syngéniques, le vaccin à base de cellules dendritiques (DC) à base de cellules souches cancéreuses (CSC) a démontré une immunité antitumorale significativement plus élevée que les vaccins DC traditionnels pulsés avec des cellules tumorales en vrac hétérogènes.

Génération d’un nouveau vaccin à cellules dendritiques utilisant des cellules souches de mélanome et de cancer malpighien

Nous décrivons un protocole pour surveiller la mobilité radiale des cellules immunitaires non adhérentes in vitro à l’aide d’un appareil de sédimentation cellulaire. La migration cellulaire est suivie sur des monocouches de cellules tumorales ou sur des protéines de la matrice extracellulaire. L’examen par microscopie optique et à fluorescence permet d’observer la mobilité cellulaire et la fonctionnalité cytotoxique.

Radial Mobilité et cytotoxiques fonction de réplication rétrovirale Vector transduits, non-adhérent Alloresponsive lymphocytes T

Des sous-ensembles distincts de cellules dendritiques existent en tant que populations rares dans les organes lymphoïdes, et sont donc difficiles à isoler en nombre suffisant et en pureté suffisante pour des expériences immunologiques. Nous décrivons ici une méthode à haute efficacité et à haut rendement pour l’isolement de tous les principaux sous-ensembles actuellement connus de cellules dendritiques spléniques de souris.

Une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

L’objectif de ce protocole est de montrer le protocole de reprogrammation des lymphocytes infiltrant le mélanome en cellules souches pluripotentes induites.

Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

Cet article décrit une nouvelle méthode pour produire des émigrants thymiques pluripotents induits par l'antigène-spécifique de tumeur (iTE) par un système de culture thymique tridimensionnel (3D). iTE sont un sous-ensemble homogène de lymphocytes T étroitement liés aux lymphocytes T naïfs avec la capacité de prolifération, de formation de mémoire, et de suppression de tumeur.

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

Nous décrivons ici un essai de tuerie in vivo basé sur la cytométrie en flux qui permet l’examen de l’immunodominance dans les réponses cytotoxiques des lymphocytes T (CTL) à un antigène tumoral modèle. Nous fournissons des exemples de la façon dont ce dosage élégant peut être utilisé pour les études mécanistes et pour les tests d’efficacité des médicaments.

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Cet article décrit une méthode pour produire l'antigène fonctionnel induit par l'antigène-spécifique pluripotent cD8MD- cellules T positives uniques utilisant le système de co-culture D'OP9/DLL1.

Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral

Présenté ici est un protocole pour la suppression efficace de la réplication du virus de l'hépatite B (HBV) chez les souris en utilisant le transfert de cellules adoptives (ACT) de cellules souches dérivées des lymphocytes T spécifiques à l'antigène viral (Ag). Cette procédure peut être adaptée pour l'immunothérapie act-basée potentielle de l'infection de HBV.

Les lymphocytes T T spécifiques à la cellule souche s'amedisent à supprimer la réplication du VHB chez les souris

Découvrez la reprogrammation in vivo de cellules tumorales en cellules dendritiques cDC1 pour l'immunothérapie anticancéreuse chez la souris. Cette méthode transforme les tumeurs froides en tumeurs chaudes et stimule l'immunité antitumorale durable.

Reprogrammation in vivo de cellules tumorales en cellules dendritiques conventionnelles de type 1

Explorer plus de vidéos