SCAnED - Une macro de segmentation cutanée open-source pour la détection semi-automatisée des cellules et des noyaux dans les compartiments cutanés épidermiques et dermiques

Dans nos travaux, nous étudions les mécanismes régulateurs qui maintiennent l’homéostasie tissulaire aux niveaux moléculaire, cellulaire, structurel et mécanique. Notre objectif est de comprendre des pathologies, telles que l’inflammation de la peau ou le cancer. Grâce à de nouveaux outils d’imagerie haute résolution et de multiomique, nous pouvons désormais cartographier les changements d’expression cellulaire et génique des tissus en 2D et en 3D.

Cela renforce vraiment notre compréhension de la façon dont les maladies se développent et progressent. L’un des grands défis actuellement est la quantité massive de données générées par la microscopie avancée. Et bien qu’il existe plus d’outils pour analyser les images, ils ne sont souvent pas faciles à utiliser pour les personnes sans beaucoup d’expérience, ou sont assez coûteux.

Notre protocole propose un outil gratuit et convivial pour analyser les cellules de la peau humaine à la fois de l’épiderme et du derme. Cela améliore la précision par rapport aux outils généraux, et ne nécessite pas d’expérience préalable en codage ou en analyse d’images. Pour commencer, ouvrez les images d’immunofluorescence à Fiji ou Image J, en utilisant les formats bio avec les paramètres par défaut.

Ne divisez pas les canaux pendant cette étape. Télécharge la macro SCAnED et lance-la en sélectionnant les plugins. Puis les macros et le clic sur exécuter.

Sélectionnez le fichier de script macro SCAnED quand on le demande. Suivez les instructions à l’écran fournies par la macro. Sélectionnez le canal E-cadherin lorsque la macro vous l’invite à l’appel.

Ensuite, naviguez jusqu’à l’image, choisissez ajuster, puis seuil pour ajuster manuellement le seuil du canal E-cadherin. Cliquez sur OK une fois que la région épidermique est entièrement capturée. Ensuite, sélectionnez le canal DAP-E lorsque vous êtes invité à procéder à la segmentation.

Définir automatiquement les niveaux d’intensité pour la segmentation des noyaux lors de l’utilisation de la fonction seuil. Pour StarDist, ouvrez le plugin dans Image J. Chargez le modèle de détection des noyaux dans l’interface graphique StarDist, puis cliquez sur le canal des noyaux pour le sélectionner pour analyse. Ajustez maintenant les paramètres de tuiles dans StarDist pour correspondre à la taille attendue du patch de 256 par 256 pixels.

Lorsque vous êtes invité, sélectionnez oui pour mesurer l’intensité des marqueurs dans les noyaux. Ensuite, répétez le processus de segmentation et d’analyse pour chaque canal de fluorescence. Après le traitement de tous les canaux, enregistrez les données de sortie sous forme de fichiers de valeurs séparées par des virgules, comme indiqué par la macro.

Pour la région cytoplasmique, lorsque la segmentation du noyau a été effectuée en utilisant la fonction seuil, on applique une dilatation binaire pour étendre la région nucléaire d’intérêt. Lorsque StarDist a été utilisé pour la segmentation des noyaux, appliquez une expansion d’élargissement à la région nucléaire d’intérêt. Sélectionnez oui lorsque vous êtes invité pour mesurer l’intensité des marqueurs dans toute la région cellulaire.

Ensuite, sauvegardez les fichiers de données résultants sous forme de valeurs séparées par virgules selon les instructions macro. Établir des seuils d’intensité spécifiques aux marqueurs à l’aide d’échantillons isotypes témoins. Téléchargez le carnet Jupyter approprié, puis allez dans Google Collaboration pour sélectionner le fichier, puis ouvrir le carnet.

Choisissez le fichier et exécutez les cellules de code séquentiellement. Lorsque vous êtes invité par l’option choisir des fichiers, cliquez sur le bouton et téléchargez le fichier de valeurs séparées par virgule. Pour chaque anticorps, calculez l’intensité moyenne de fluorescence à l’aide des fichiers contrôle isotype.

Pour déterminer les seuils de coupure, ouvrez le carnet de points de points, téléchargez les données de contrôle des isotypes, puis exécutez le code. En fonction de la distribution des points dans les graphiques pour les données témoins d’isotype et les données spécifiques d’anticorps, on sélectionne un seuil d’intensité pour distinguer le signal de fond de l’expression réelle du marqueur. Utilisez ce seuil pour classer chaque cellule comme positive ou négative pour le marqueur donné.

Enfin, créez des diagrammes de points pour visualiser les motifs de co-expression des marqueurs en exécutant le code du graphique de points dans le carnet Google Collab. Dans les images segmentées manuellement, les cellules positives à la vimentine ont montré un signal cytoplasmique fort avec des frontières claires du ROI couvrant l’ensemble du corps cellulaire. La segmentation semi-automatisée SCAnED a capturé des cellules positives à la vimentine avec des frontières similaires en utilisant une approche de seuil et de dilatation.

La comparaison quantitative de l’intensité de vimentine dans 21 cellules n’a montré aucune différence significative entre la segmentation manuelle et la segmentation SCAnED. L’analyse histographique a révélé une fréquence plus élevée de cellules positives à la vimentine dans le derme du psoriasis comparée à une peau saine. L’analyse par diagramme de points des cellules dermiques a montré une augmentation des cellules positives à la vimentine pour le CD-90 dans le psoriasis par rapport à la peau saine.

Dans l’épiderme, les échantillons de psoriasis ont montré une augmentation des cellules négatives à la vimentine CD-90, possiblement des kératinocytes, par rapport à la peau saine. Les numéros cellulaires positifs à la vimentine dans l’épiderme psoriasique et sain étaient comparables entre SCAnED et QuPath. la segmentation visuelle a montré que SCAnED attribuait plus précisément des cellules bordantes à l’épiderme que QuPath, qui en attribuait plusieurs à tort.