Développement de lignées organoïdes dérivées de souris à partir de cellules épithéliales de trompes de Fallope pour la modélisation du carcinome de l’ovaire séreux de haut grade

Donc oui, nous travaillons actuellement au développement de nouveaux modèles de carcinome ovarien séreux de haut grade, des modèles syngéniques dans le sens où le protocole le décrit. Nous prenons les trompes de Fallope saines de souris saines, puis nous les déduisons sous forme d’organoïdes dans la boîte de Petri, puis nous leur attribuons toutes les différentes erreurs ou modifications génétiques que nous trouverions habituellement dans une version humaine normale de la maladie. C’est très intéressant car d’un côté, on peut étudier toutes sortes de facteurs intrinsèques de ces tumeurs à l’intérieur de la boîte de Petri sous forme d’organoïdes, qui sont plus réalistes que les cultures 2D traditionnelles.

Mais le fait est que, puisqu’il existe des modèles syngéniques, on peut ensuite prendre ces organoïdes et les remettre dans une souris, et ensuite voir comment la tumeur se développe et interagit avec l’hôte. Cela nous permet d’avoir une vision beaucoup plus holistique de la façon dont une tumeur et la tumorigenèse se produisent, ce que nous espérons nous donnera de bien meilleurs outils et une bien meilleure compréhension du fonctionnement de cette maladie et de la meilleure lutte. Pour commencer, on obtient des femelles noires 6J euthanasiées.

Retirez l’ovaire et la trompe de Fallope et transférez-les dans une boîte de Petri stérile contenant du DMEM, complétée avec de la pénicilline streptomycine à quatre degrés Celsius. Utilisez un microscope disséqueur, des pinces fines et des ciseaux pour retirer la graisse résiduelle de l’ovaire. Isoler la trompe de Fallope, y compris l’infundibule, et une partie de l’ampouille distale de l’ovaire et de l’utérus.

Transférez maintenant les tissus nettoyés dans un tube contenant le mélange digestif complet. Avec une paire de ciseaux fins, hachez la trompe de Fallope en morceaux de moins de 0,5 millimètre. Ensuite, incubez le tube à 37 degrés Celsius pendant 40 à 50 minutes avant d’effectuer la culture organoïde.

Pour développer le modèle tumoral de souris, mettez en place cinq injections, chacune contenant quatre millions de cellules resuspendues dans un Opti-MEM I non supplémenté, une matrice membranaire basale glacée. Pour préparer les injections, il faut d’abord expulser les bulles d’air du volume mort d’une seringue d’insuline U-100 équipée d’une aiguille de calibre 28 à l’aide de PBS froid. Ensuite, chargez lentement la seringue avec 40 microlitres de cellules et gardez les seringues chargées sur la glace jusqu’à ce que les souris soient anesthésiées.

Une fois prêtes pour l’injection, placez les seringues à côté d’une lampe chauffante pour permettre à la matrice membranaire du socle de se réchauffer et augmenter la viscosité, facilitant ainsi l’injection et l’engraftage. Ensuite, placez une souris dans une cage préchauffée sous une lampe chauffante pour préparer une opération. Faire une incision de moins d’un centimètre le long du flanc, au-dessus de la cuisse d’une souris anesthésiée.

Coupez à travers l’épiderme et l’hypoderme pour atteindre la région bursaine. Retirez doucement l’ovaire en localisant le coussin graisseux attaché. Ensuite, à l’aide d’une seringue préparée, injectez les cellules à travers le coussinet adipeux et l’ovaire dans le sac oviductuel.

Remet soigneusement l’ovaire dans la bourse. Fermez la couche musculaire avec des points non tressés. Ensuite, fermez l’incision cutanée à l’aide d’agrafes chirurgicales.

Remettez la souris dans la cage chauffée et maintenez la température corporelle avec une lampe chauffante jusqu’à ce qu’elle soit à moitié consciente, généralement pendant plus de 15 minutes. Les organoïdes dérivés de l’épithélium des trompes de Fallope murines ont une forme sphérique bien définie et claire après environ cinq jours, nécessitant un emballage entre le 10e et le 12e jour. Les organoïdes de type sauvage sont transformés en tumoroïdes précancéreux à l’aide de techniques de génie génétique, telles que la surexpression lentivirale ou rétrovirale des gènes.

Les lignées cellulaires clonées uniques dérivées des organoïdes génétiquement modifiés peuvent être étudiées in vivo par injection dans la bourse ovarienne. Les tumeurs atteignent généralement une taille de deux à trois centimètres environ 60 jours après l’injection. Eh bien, nous disons cela vraiment, comme je l’ai indiqué plus tôt, que le plus grand avantage du fonctionnement de ce protocole, bien sûr, est de générer ces modèles syngéniques, n’est-ce pas ?

Et donc, comme ils sont syngéniques, comme je l’ai dit plus tôt, on peut vraiment apprécier toute l’interaction entre, vous savez, un animal complet, une souris complète, vous savez, et la tumeur que vous développez tout en ayant un contrôle total sur la génétique de la tumeur. Et donc, bien sûr, comparé à d’autres modèles où vous essayez peut-être de comprendre le système immunitaire à l’intérieur de la boîte de Petri, il sera bien sûr très difficile de répliquer le système immunitaire dans la boîte de Petri. Ou si vous prenez des PDX, c’est-à-dire des échantillons de tumeurs de patients que vous mettez ensuite chez des souris, pour que cela fonctionne, les souris ne peuvent pas avoir de système immunitaire sinon elles rejettent cette tumeur, n’est-ce pas ?

Mais puisque ce modèle est syngénique, on peut vraiment apprécier toute l’interaction de l’hôte dans son ensemble avec la tumeur et particulièrement avec le système immunitaire, qui est actuellement l’un des domaines de recherche les plus en vogue dans le domaine. Je pense donc vraiment que c’est l’avantage le plus important de ce protocole par rapport à d’autres protocoles que l’on trouve ailleurs. En fait, nous utilisons déjà ces modèles pour étudier des phénomènes très intéressants.

Je dirais que ce qui m’intéresse le plus en ce moment, c’est comment le système immunitaire adaptatif, d’après ce que nous avons vu, semble être un facteur majeur dans la formation des propriétés génomiques, en particulier les variations du nombre de copies des carcinomes séreux de l’ovaire de haut grade, dans le sens où si le système immunitaire n’est pas là, il semble que ces tumeurs ne développent pas de tels réarrangements d’ADN massifs et complexes. Nous essayons donc de comprendre comment cela se produit et comment, espérons-le, pourrions essayer de la renverser afin de potentialiser toute forme de thérapie immunitaire contre cela.