Optimisation rapide d’un système inductible par la lumière pour contrôler l’expression génique de mammifères

Ce projet vise à développer une méthode à haut débit pour optimiser et caractériser un outil optogénétique multi-composantes appelé LACE pour l’expression génique chez les mammifères. Pour commencer, placez un flacon de culture cellulaire contenant des cellules T HEK 293 dans un cabinet de biosécurité. Utilisez une pipette sérologique pour aspirer le milieu utilisé.

Pipeter 10 millilitres de DPBS dans un coin de la fiole et faire doucement tourner les cellules pour laver les cellules. Ensuite, aspirez la solution de lavage et jetez à la fois le DPBS et l’aspirateur dans le contenant à déchets. Ajoutez maintenant 1,5 millilitres de Trypsine-EDTA à 0,05 % à la fiole pour recouvrir la surface, puis incubez.

Tapotez doucement la fiole pour détacher les cellules de la surface. Ensuite, pipettez 8,5 millilitres de DMEM frais dans la fiole. Aspirez la solution vers le haut et vers le bas jusqu’à ce qu’aucun agrégat ne soit visible pour resuspendre les cellules.

Ensuite, on transfère neuf millilitres de la suspension de la cellule dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez neuf millilitres de DMEM frais à la fiole. Incubez la suspension jusqu’à une confluence inférieure à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.

Maintenant, mélangez 10 microlitres des cellules en suspension avec 10 microlitres de colorant trypsine à un ratio un pour un pour calculer la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Ensemencer environ 35 000 cellules dans 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque noire à fond en verre de calibre haute performance de 1,5 %. Placez l’assiette dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Pour la transfection, il faut d’abord ajouter 11 microlitres de DMEM chaud sans sérum dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre pour un puits et 10 % de surplus. Préparez divers rapports de masse plasmidiques de la protéine fluorescente verte améliorée par CRY2 à l’ARN/Aliquote CIBN-guide 110 nanogrammes par puits des solutions préparées dans chaque tube contenant les aliquotes du milieu sans sérum. Ensuite, pipettez 11 microlitres supplémentaires de DMEM sans sérum pour chaque puits dans des tubes séparés pour la dilution du réactif de transfection.

Ajoutez le réactif de transfection dilué au mélange de milieu d’ADN et incubez pour former les complexes de transfection. Ensuite, pipeter 20 microlitres du complexe de transfection préparé vers chaque puits de la plaque de 96 puits contenant les cellules T HEK 293. Enveloppez la plaque à 96 puits dans du papier aluminium et placez-la dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Pour commencer le processus d’activation, modifiez le code d’entrée du microcontrôleur afin d’illuminer les puits désirés en utilisant les lignes de script spécifiées. Réglez l’intensité de la diode électrolumineuse à 9,27 milliwatts par centimètre carré en utilisant les lignes de code indiquées. Ajustez la durée de l’impulsion à une seconde, puis réglez la fréquence de l’impulsion à 0,067 hertz, soit tous les 15 secondes.

Vaporisez le couvercle imprimé en 3D de l’optoPlate avec 70 % d’éthanol. Ensuite, laissez-la sécher dans un meuble de biosécurité. Maintenant, allumez une lampe rouge dans la chambre noire.

Placez la plaque à 96 puits dans l’armoire de biosécurité. Remplacez le couvercle de la plaque par le couvercle séché imprimé en 3D. Placez la plaque à 96 puits sur le réseau LED pour assembler l’appareil d’activation.

Placez l’appareil entièrement assemblé à LED dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Connectez le microcontrôleur, la diode électrolumineuse et les ports ventilateur à une source d’alimentation. Pour effectuer la cytométrie en flux, exécutez le programme de démarrage du système sur le logiciel expert du site.

Chargez deux millilitres d’eau déionisée dans le chargeur d’échantillons. Effectuez le contrôle qualité à l’aide des billes de contrôle qualité fournies. Configurez et spécifiez les puits d’échantillonnage à obtenir.

Créez les graphiques et tableaux pour la dispersion latérale versus la diffusion directe, la hauteur de dispersion latérale versus la surface de dispersion latérale, la surface de dispersion latérale par rapport au FITC-A, et le tableau statistique du FITC-A. Maintenant, insérez la plaque à 960 puits en V dans le chargeur de plaques du cytomètre. Sélectionnez un puits non transfecté et cliquez sur Initialiser, suivi de Exécuter.

Ajustez la diffusion latérale et les tensions FITC pour centrer la population d’intérêt sur le graphique SSC-A versus FSC-A. Cliquez sur Exécuter, puis sélectionnez une protéine fluorescente verte bien transfectée par CMV. Ajustez la tension FITC pour inclure à la fois les cellules autofluorescentes et fluorescentes dans le graphique SSC-A versus FITC-A.

Créez un polygone pour verrouiller la population cellulaire saine. Un second polygone pour verrouiller la discrimination des doublets sur le graphique SSC-H versus SSC-A. Créez une porte polygonale pour distinguer les cellules fluorescentes des cellules non fluorescentes en utilisant la porte des cellules non transfectées comme référence.

Enregistrez automatiquement les échantillons à 60 microlitres par minute jusqu’à ce que 200 secondes soient écoulées ou que 10 000 événements aient été atteints. Ensuite, j’exporte les valeurs moyennes FITC sous forme de fichier CSV et j’analyse les données. Nettoyez le cytomètre à flux en sélectionnant l’option de nettoyage quotidien.

L’imagerie par fluorescence a montré qu’à un ratio de masse de un pour neuf, l’activation de la lumière bleue induisait une expression maximale d’eGFP plus faible comparée au rapport de cinq pour cinq, qui présentait également une fuite accrue dans l’obscurité. La cytométrie en flux a montré que plus de 95 % des événements à portes dans P1 étaient des singlets dans toutes les conditions. Et les cellules non transfectées présentaient moins de 0,1 % de population positive à l’eGFP.

Le groupe témoin CMV-eGFP avait environ 99 % de cellules positives à l’eGFP, tandis que les cellules transfectées à 2 LACE environ 57 %. Les cellules transfectées par CMV-eGFP ont montré une forte expression constitutive d’eGFP dans des conditions claires et sombres, tandis que les cellules non transfectées n’ont montré aucune fluorescence visible. Il a également confirmé la transfection réussie de 2pLACE et l’activation de l’expression d’eGFP sous lumière bleue avec une expression plus faible que la CMVeGFP. Une triple augmentation de l’expression d’eGFP a été observée dans les échantillons de 2pLACE activés par la lumière par rapport aux conditions sombres.

Le pourcentage de cellules eGFP positives dans les échantillons transfectés à 2 pLACE était d’environ 60 %. Le rapport massif de trois pour sept a produit l’intensité de fluorescence moyenne et la plage dynamique les plus élevées. Ce protocole permet l’évaluation à haut débit des échantillons et la réplication technique à l’aide de l’optoPlate pour programmer des conditions lumineuses et des fréquences d’impulsion variables.