Stimulation de cellules endothéliales vasculaires à l’aide de pièges extracellulaires de neutrophiles en présence de lipoprotéines de basse densité

Les pièges extracellulaires neutrophiles sont impliqués dans diverses maladies, y compris les maladies cardiovasculaires. Cependant, les effets synergiques de la formation de TNE et des lipoprotéines sur les cellules vasculaires restent incertains. À l’aide de ce protocole, l’analyse mécaniste est en cours à ce jour de la manière dont les réponses inflammatoires sont induites dans les cellules endothéliales aortiques humaines traitées avec des pièges extracellulaires de neutrophiles et des lipoprotéines de basse densité.

Nous avons démontré que les lipoprotéines de haute densité agissent comme un suppresseur de la formation de NET. Ceci est favorisé par les lipoprotéines de basse densité oxydées, les phospholipides oxydés et les lysophospholipides. Pour commencer, centrifugez 45 à 50 millilitres de sang total humain obtenu dans un tube d’héparine à 700 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Réduisez lentement la vitesse de la centrifugeuse après l’essorage, puis récupérez la couche supérieure contenant la fraction plasmatique. Centrifugez la fraction plasmatique deux fois à 700 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer complètement les cellules sanguines, en maintenant le même réglage de décélération. Ajoutez ensuite un microlitre de solution EDTA de 250 millimolaires pour un millilitre de plasma pour empêcher l’oxydation des lipoprotéines médiée par des ions métalliques divalents.

Placez 2,7 millilitres de plasma dans le tube de l’ultracentrifugeuse. Superposition avec 900 microlitres de PBS contenant 250 micromolaires d’EDTA. Ensuite, ultracentrifugez le tube à 600 000 G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, jetez 900 microlitres de la couche supérieure pour éliminer la fraction chylomicronique. Ajoutez 900 microlitres de PBS contenant de l’EDTA sur le plasma restant et ultracentrifugez à 600 000 G pendant 2,5 heures à quatre degrés Celsius. Jetez 900 microlitres de la couche supérieure pour éliminer la fraction de lipoprotéines de très basse densité.

Ajoutez ensuite 540 microlitres de 0,5 gramme par millilitre de solution de bromure de potassium au plasma pour ajuster la densité à 1,063. Mélangez délicatement le contenu à l’aide d’une pipette et d’une ultracentrifugeuse à 600 000 G pendant 2,5 heures à quatre degrés Celsius. Collectez 540 microlitres de la couche supérieure contenant des lipoprotéines de basse densité.

Transférez la fraction collectée dans une membrane de dialyse et dialysez contre deux litres de PBS contenant de l’EDTA à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pour éliminer le bromure de potassium. Ajoutez 152 microlitres de solution de polylysine à 0,01 % ou de gélatine à 0,1 % dans chaque puits d’une plaque à 12 puits et laissez incuber à température ambiante pendant au moins cinq minutes. Ensuite, retirez la solution des puits, lavez une fois avec 200 microlitres d’eau stérile et laissez les puits sécher complètement à température ambiante.

Conservez la plaque préparée à température ambiante jusqu’à nouvel ordre. Préparez les plaques recouvertes de gélatine en suivant la même procédure que celle décrite pour la polylysine. Culture deux fois dix à la puissance six cellules HL60 par 10 millilitres dans le milieu RPMI-1640, complétée par deux micromolaires d’acide rétinoïque tout-trans.

Après quatre jours d’incubation avec de l’acide rétinoïque tout-trans, prélever les cellules HL60. Centrifugez les cellules collectées à 220 G pendant quatre minutes à 18 à 22 degrés Celsius. Aspirez le surnageant, puis lavez les cellules avec un volume égal de milieu RPMI-1640 sans sérum.

Centrifugez à nouveau les cellules lavées à 220 G pendant quatre minutes à 18 à 22 degrés Celsius et remettez les cellules en suspension dans un milieu RPMI-1640 sans sérum. Après avoir ajusté la concentration cellulaire à deux fois dix à la puissance six cellules par millilitre, ensemencez 0,5 millilitre de suspension dans chaque puits d’une plaque à 12 puits pré-enduite de polylysine. Ajoutez 100 microlitres de milieu RPMI-1640 sans sérum avec ou sans phorbol 12-myristate, 13-acétate ou PMA à 300 nanomolaires.

Cultivez les cellules pendant 30 minutes. Ensuite, retirez le milieu des puits. Lavez les cellules une fois avec le milieu RPMI-1640 sans sérum et remplacez-le par du RPMI-1640 sans sérum contenant zéro ou 20 microgrammes par millilitre de lipoprotéines de basse densité.

Continuez à cultiver les cellules pendant deux heures. Prélever le milieu de culture de chaque puits dans un tube et centrifuger à 700 G pendant trois minutes à 18 à 22 degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Pour la stimulation, obtenir la culture de cellules endothéliales de l’aorte humaine et remplacer le milieu épuisé par 0,5 millilitre de milieu de culture frais, et incuber les cellules pendant 30 minutes.

Enfin, ajoutez 167 microlitres du milieu de culture prélevé sur des cellules de type neutrophile contenant des pièges extracellulaires de neutrophiles et des LDL dans des boîtes de cellules endothéliales aortiques humaines. La stimulation des cellules endothéliales de l’aorte humaine à l’aide de pièges extracellulaires neutrophiles a entraîné des changements morphologiques dose-dépendants, passant d’une forme semblable à un pavé à une forme allongée. Les changements morphologiques dans les cellules endothéliales aortiques humaines ont été améliorés lorsqu’ils étaient stimulés par des pièges extracellulaires neutrophiles induits par le LDL, avec une élongation visible apparente dès six heures.