Plate-forme d’imagerie sans lentille déployable sur le terrain pour une analyse rapide sans marquage de l’activation des cellules tueuses naturelles

Notre objectif est d’évaluer rapidement la fonction immunitaire en quantifiant l’activation des cellules NK en temps réel, à l’aide d’une imagerie sans marquage et sans lentille pour améliorer la surveillance immunitaire. Nous avons montré que l’indice d’immunité innée, ou I3, distingue de manière fiable l’activité des cellules NK des donneurs sains et immunodéprimés et qu’il est fortement corrélé avec les cytokines et les marqueurs de cytométrie en flux. Les tests existants sur cellules NK nécessitent des étiquettes, des instruments encombrants et de longues durées d’incubation.

Notre plateforme LSIT comble cette lacune en permettant un profilage rapide, abordable et sans étiquette à l’aide d’une simple optoélectronique. Notre plateforme LSIT sans marquage différencie l’activation des cellules NK au niveau d’une seule cellule en 30 secondes à l’aide de paramètres d’ombre, éliminant ainsi le besoin de coloration et de cytométrie en flux coûteuse. Nous étendrons le LSIT pour surveiller l’activation des lymphocytes T et B et intégrerons des algorithmes d’apprentissage profond pour la classification à haut débit de différents états des cellules immunitaires.

Pour commencer, retirez les kits d’isolement cellulaire Natural Killer, ou NK, du réfrigérateur et laissez-les atteindre la température ambiante, entre 15 et 28 degrés Celsius. Préparez l’équipement requis en plaçant un séparateur magnétique, des pipettes avec des pointes stériles et réglez un incubateur ou un bloc chauffant à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette, ajoutez 0,5 millilitre de sang total dans le tube réactionnel à capuchon vert contenant le cocktail d’anticorps.

Mélangez doucement le contenu en pipetant cinq à six fois de haut en bas du tube. Ensuite, incubez le tube pendant cinq minutes. Transférez tout le contenu du tube à bouchon vert dans le tube de séparation à bouchon rouge à l’aide d’une pipette, et mélangez doucement en pipetant le tube cinq à six fois.

Placez le tube à capuchon rouge sur le séparateur magnétique et incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Tout en maintenant l’aimant en place, utilisez une pipette pour transférer environ 1,5 millilitre de surnageant dans le tube de séparation à capuchon violet deux. Mélangez doucement le contenu en pipetant le tube cinq à six fois.

Maintenant, placez le tube à capuchon violet sur le séparateur magnétique et incubez pendant 10 minutes. Pendant que l’aimant est toujours en place, transférez environ 1 millilitre de surnageant dans un tube de récupération avec un couvercle gris à l’aide d’une pipette, et mélangez soigneusement le contenu en pipetant le tube. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de suspension isolée de cellules tueuses naturelles dans le tube du véhicule et 100 microlitres supplémentaires dans le tube du cocktail de stimulation d’activation, ou tube ASC.

Mélangez doucement le contenu des deux tubes à l’aide d’un mélangeur vortex pour assurer une distribution uniforme. Incuber les tubes dans le bloc chauffant ou l’incubateur réglé à 37 degrés Celsius pendant une heure. Allumez la plateforme LSIT.

Lancez le logiciel de capture LSIT. Connectez-vous en saisissant votre identifiant et votre mot de passe, puis sélectionnez Calibrer pour lancer le mode d’étalonnage. Appuyez sur le bouton Ouvrir sur l’écran tactile ou utilisez le bouton physique de la porte coulissante pour ouvrir le tiroir.

Lorsque le tiroir s’ouvre, retirez la glissière d’étalonnage et rangez-la. Maintenant, cliquez sur Définir l’arrière-plan pour calibrer l’intensité optique. Replacez la glissière d’étalonnage dans le tiroir et fermez le tiroir.

Ensuite, cliquez sur Démarrer l’étalonnage pour terminer le processus. Retirez une lame de test de sa poche. Étiquetez-le avec les données de l’échantillon avant de le placer sur une surface propre et plane.

Pipetez 10 microlitres de l’échantillon du véhicule dans les canaux A et B, puis pipetez 10 microlitres de l’échantillon stimulé par ASC dans les canaux C et D.Maintenant, appuyez sur Ouvrir pour éjecter le tiroir. Retirez la lame d’étalonnage et placez-la dans une boîte de rangement. Insérez la glissière de test préparée dans le tiroir et appuyez sur Fermer pour la fixer.

Retournez au menu principal et sélectionnez l’activité et le test de la cellule NK à partir de l’écran principal. Entrez l’ID de l’échantillon ou scannez le code-barres pour charger le profil d’échantillon. Ensuite, appuyez sur Capturer pour commencer l’enregistrement de l’image.

Après avoir capturé l’image, cliquez sur Analyser pour commencer le traitement. Vérifiez le pourcentage d’activité des cellules NK et le nombre de cellules affichés à l’écran. Téléchargez les résultats sur une clé USB ou imprimez-les à l’aide du menu de l’écran tactile.

Sélectionnez Comptage de cellules et Test sur l’interface principale de LSIT. Chargez 10 microlitres du nouvel échantillon sur un nouveau canal de lame de test à l’aide d’une pipette. Insérez la glissière dans le tiroir.

Fermez le tiroir à l’aide de l’écran tactile ou du bouton et entrez l’ID de l’échantillon sur le système. Entrez le facteur de dilution sur l’écran tactile, le cas échéant, et appuyez sur Comptage pour commencer la quantification des cellules. Affichez les résultats affichés sous forme de cellules par microlitre à l’écran.

Après l’analyse, ouvrez le tiroir en appuyant sur le bouton Ouvrir ou en basculant l’interrupteur physique. Retirez la glissière usagée du tiroir à l’aide de mains gantées. Enfin, replacez la glissière d’étalonnage dans le tiroir pour protéger le capteur et fermez le tiroir à l’aide de l’écran tactile ou de l’interrupteur à bascule physique.

La plateforme LSIT avec logiciel intégré a évalué quantitativement l’activation des cellules NK en comparant les valeurs CSP des cellules témoins activées et non stimulées. Il a fourni au rapport sur l’immunité un tableau statistique résumé. La stimulation ASC a induit des changements morphologiques clairs dans les cellules NK, y compris une augmentation de la taille et de la complexité cytoplasmique, comme on le voit dans les cytospins colorés à Hema 3 après 30 minutes et deux heures.

Les images d’ombre ont montré que les cellules stimulées par l’ASC avaient des motifs de diffraction visiblement plus complexes que les témoins de véhicule, les paramètres extraits indiquant une augmentation de la distance de crête à crête, de la granularité cytoplasmique et du paramètre d’ombre combiné. Les valeurs combinées des paramètres d’ombre ont permis une classification claire entre les donneurs sains et les patients cancéreux, avec un chevauchement minimal dans les distributions de cellules NK activées et non activées. Les donneurs sains ont montré des valeurs d’indice d’immunité innée significativement plus élevées que les patients cancéreux après stimulation ASC.