Name: Détection sur site de l’ADN des parasites trypanosomatidés et de Nosema ceranae par lyse alcaline couplée au système RPA/CRISPR/Cas12a (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Découvrez une méthode de diagnostic rapide des pathogènes des abeilles utilisant l'amplification RPA couplée au CRISPR/Cas12a. Cette approche isotherme détecte Lotmaria passim et Nosema ceranae avec une sensibilité supérieure au QPCR.

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<ol><li>Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bee+declines+driven+by+combined+stress+from+parasites%2C+pesticides%2C+and+lack+of+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers.</a> Science. 347 (6229), 1255957(2015).</li>
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<li>Aman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iSCAN-V2%3A+a+one-pot+RT-RPA-CRISPR%2FCas12b+assay+for+point-of-care+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">iSCAN-V2: a one-pot RT-RPA-CRISPR/Cas12b assay for point-of-care SARS-CoV-2 detection.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 800104(2022).</li>
<li>Peng, R., Lu, Z., Liu, M., Hu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-RPA-assisted+CRISPR%2FCas12a+for+rapid+and+multiplex+detection+of+respiratory+infectious+viruses+based+on+centrifugal+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-RPA-assisted CRISPR/Cas12a for rapid and multiplex detection of respiratory infectious viruses based on centrifugal microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 399, 134838(2024).</li>
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<li>Nguyen, L. T., Smith, B. M., Jain, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+trans-cleavage+activity+of+Cas12a+with+engineered+crRNA+enables+amplified+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection.</a> Biochemistry. 59 (17), 1474-1481 (2020).</li>
<li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+lyophilized+CRISPR%2FCas12a+and+RPA+assay+for+rapid+detection+of+Actinobacillus+pleuropneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem+J%22%5BJournal%5D)">Application of a lyophilized CRISPR/Cas12a and RPA assay for rapid detection of Actinobacillus pleuropneumoniae.</a> Microchem J. 206, 111443(2024).</li>
<li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+all-in-one+RPA-Cas12a+strategy+with+de+novo+autodesigner+and+its+application+in+on-site+ultrasensitive+detection+of+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses.</a> Biosens Bioelectron. 239, 115609(2023).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6641">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68871">10.3791/68874</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68874">On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

<table><tbody><tr><td>Tubes Eppendorf sans DNAse ni ARNASE de 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>Référence MTC-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf de 1,5 mL sans DNAse ni RNAse</td><td>Axygen</td><td>Référence MTC-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu ; L pointes filtrées à faible rétention</td><td>LabClinics</td><td>Référence 5-063-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; L pointes filtrées à faible rétention</td><td>LabClinics</td><td>Référence 5-120-P5-0</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu ; L pointes filtrées à faible rétention</td><td>LabClinics</td><td>Référence 5-203-P4-0</td><td></td></tr><tr><td>BH-200 Series Stuart Chauffage à bloc sec</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-36610-00</td><td></td></tr><tr><td>Eau traitée au DEPC</td><td>Ambicon</td><td>Référence AM9906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Pilons en microtubes</td><td>Fisherbrand</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>Milenia GenLine HybriDetect</td><td>Milenia</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>RPA kit TwistAmp Liquid Basic</td><td>TwistAmp</td><td>&nbsp ; TALQBAS01</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Chanel Simple PIPETMAN P1000L Micropipette Éjection métallique</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Single Chanel PIPETMAN P100L Micropipette Éjection Métallique</td><td>Gilson</td><td>F144057M</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Chanel Unique PIPETMAN P10L Micropipette Éjection métallique</td><td>Gilson</td><td>F144055M</td><td></td></tr><tr><td>Hypochlorite de sodium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de détection PCR en temps réel Touch</td><td>BioRad</td><td>Le CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. T1503</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Liquide de base</td><td>Tournant</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

détection sur site de l’adn des parasites trypanosomatidés et de nosema ceranae par lyse alcaline couplée au système rpa/crispr/cas12a

On-site DNA Detection of Trypanosomatid Parasites and Nosema ceranae Through Alkaline Lysis Coupled to RPA/CRISPR/Cas12a System

Ici, nous avons décrit une méthode rapide sur site utilisant la lyse alcaline de l’abdomen des abeilles ouvrières couplée à l’amplification RPA et à la détection basée sur CRISPR/Cas12a par des approches de fluorescence et/ou de flux latéral. Le schéma de l’ensemble du flux de travail est représenté à la figure 3, et le schéma de la lyse alcaline HotSHOT de l’abdomen des abeilles ouvrières est illustré à la figure 4. Les résultats représentatifs du test RPA/CRISPR/Cas12a sont présentés à la figure 5. Pour détecter L. passim et N. ceranae, un thermocycleur a été utilisé pour quantifier les unités de fluorescence relative (UFR) à l’aide d’une sonde marquée FAM (Figure 4A). Les réactions RPA ont été réalisées à l’aide de 10 ng d’ADN, et les données de fluorescence ont été tracées dans un graphique (Figure 4B). À l’étape finale de l’essai, des échantillons dans des tubes coniques ont été photographiés à l’aide d’un système d’imagerie sur gel (figure 4C). Pour la détection à l’aide d’une sonde marquée à la biotine, les échantillons ont été incubés dans un thermobloc (figure 4A) ; la solution de détection a été préparée conformément aux instructions du fabricant et appliquée sur une bande d’écoulement latéral (figures 4B et C). La méthode a permis de détecter avec succès les deux agents pathogènes des abeilles.
Pour déterminer l’efficacité des réactions RPA, nous avons comparé cette méthode à la qPCR standard utilisant de l’ADN purifié d’abeilles à l’aide du kit référencé (voir le tableau des matériaux). Au total, 32 échantillons d’abeilles ont été analysés avec des amorces ciblant le gène de la β-tubuline de L. passim pour les deux méthodes, puis détectés par clivage trans-CRISPR/Cas12a de sondes fluorescentes. En conséquence, 12 échantillons se sont révélés positifs par qPCR, tandis que RPA/CRISPR/Cas12a a détecté L. passim dans 16 échantillons (Figure 5A). Cela indique que les performances de réaction RPA sont plus sensibles que celles de la PCR, en tant que méthode d’amplification de l’ADN de référence.
De même, nous avons déterminé la limite de détection (LOD) pour la qPCR et la RPA couplée à la détection CRISPR/Cas12a pour l’ADN de L. passim en tant que modèle pathogène en utilisant des dilutions en série de l’ADN de L. passim allant de 66 ng à 6 fg. La qPCR a détecté aussi peu que 6 pg, ce qui correspond à environ 96 parasites (Figure 5B). En comparaison, la LD pour l’APR correspondait à 96 parasites (figures 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig1.jpg"> 
Figure 1 : Flux de travail général de la lyse alcaline HotSHOT couplé à l’amplification RPA et aux méthodes de détection Cas12 chez les abeilles. Abréviations : RPA = amplification par polymérase recombinase ; CRISPR = répétitions palindromiques courtes groupées et régulièrement espacées ; Cas = protéine associée à CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig2.jpg"> 
Figure 2 : Traitement de la lyse cellulaire prête pour l’amplification avec le tampon HotSHOT. (A) Coupez l’abdomen de l’abeille avec un scalpel et mettez-le dans un tube à centrifuger ; (B) à l’aide d’un pilon, faire une macération avec 400 μL de HotShot ; (C) incuber sur un thermobloc à 95 °C pendant 10 min ; et (D) neutraliser avec 400 μL de Tris-HCl 40 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig3.jpg"> 
Figure 3 : Flux de travail général pour la préparation de l’enzyme Cas12a et des solutions de sonde rapporteure marquées à la FAM et à la biotine. Abréviations : DEPC-water = eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle ; ARNcr = ARN CRISPR ; Cas12 = type de protéine associée à CRISPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig4.jpg"> 
Figure 4 : Détection de Lotmaria passim et Nosema ceranae par la méthode CRISPR/Cas12a avec des sondes FAM et biotine. Pour la détection de la MAF, (A) les échantillons sont incubés dans un thermocycleur ; (B) les unités de fluorescence relative (UFR) de L. passim et de N. ceranae ; (C) visualisation des mêmes échantillons dans le cadre d’un système de photodocumentation. Dans les tests à la biotine, (a) un échantillon incubé dans un bloc thermique ; b) des échantillons ont été ajoutés dans une bandelette immunitaire du kit (voir le tableau des matériaux) ; c) les résultats après l’incubation. Abréviations : LP = Lotmaria passim ; NC = Nosema ceranae ; NTC = aucun contrôle de modèle ; RFU : unités de fluorescence relative <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68874/68874fig5.jpg"> 
Figure 5 : Comparaison entre la qPCR et la RPA, et limite de détection de Lotmaria passim. (A) Détection de L. passim dans des échantillons d’abeilles mellifères à l’aide de la qPCR et de la RPA conventionnelles. (B) Limite de détection qPCR de L. passim à l’aide de SsoFast EvaGreen. (C) Limite de détection de L. passim à l’aide de CRISPR/Cas12a avec une sonde marquée FAM ; (D) visualisation de la même détection CRISPR/Cas12a (à partir de C) sous un système d’imagerie sur gel (rangée du haut), et résultats de flux latéral correspondants à l’aide de CRISPR/Cas12a avec une sonde marquée à la biotine (rangée du bas). Abréviations : RPA = amplification par polymérase recombinase ; qPCR= réaction en chaîne par polymérase quantitative. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68874/68874fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x tampon de réaction</td>
			<td>1x</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (10 mM)</td>
			<td>1,8 million d’euros</td>
			<td>1,8 μL</td>
			<td>9 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x E-Mix de base</td>
			<td>1x</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amorce avant (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amorce inversée (10 μM)</td>
			<td>480 nM</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Mélange de réaction de noyau</td>
			<td>1x</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC Eau</td>
			<td>--</td>
			<td>0,7 μL</td>
			<td>3,7 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Composants Mastermix pour RPA avec des volumes finaux de 10 μL et 50 μL, et les concentrations de travail correspondantes :
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>Réaction de 10 μL</td>
			<td>Réaction de 50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>280 mM de MgOAc</td>
			<td>1,8 million d’euros</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADN</td>
			<td>10 à 0,1 ng</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Volume de réactifs à ajouter par échantillon dans une réaction de RPA
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactif</td>
			<td>[stock]</td>
			<td>[finale]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cas12a</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARNc</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonde FAM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>250 nM</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampon NEB 10x</td>
			<td>10 fois</td>
			<td>1x</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicon RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eau</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>32.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 3 : Concentrations de réactifs pour faire un mélange de détection de FAM par la méthode CRISPR/Cas 12a. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactif</td>
			<td>[stock]</td>
			<td>[finale]</td>
			<td>1x (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Cas12a</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>50 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARNc</td>
			<td>1 μM</td>
			<td>100 nM</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonde à biotine</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>500 nM</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampon NEB 10x</td>
			<td>10 fois</td>
			<td>1 fois</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplicon RPA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eau</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 4 : Concentrations de réactifs pour faire un mélange de détection de la biotine par la méthode CRISPR/Cas 12a.

Détection sur site de l’ADN des parasites trypanosomatidés et de Nosema ceranae par lyse alcaline couplée au système RPA/CRISPR/Cas12a

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Détection sur site de l’ADN des parasites trypanosomatidés et de Nosema ceranae par lyse alcaline couplée au système RPA/CRISPR/Cas12a

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