Détection sur site de l’ADN des parasites trypanosomatidés et de Nosema ceranae par lyse alcaline couplée au système RPA/CRISPR/Cas12a

Nos principaux intérêts de recherche portent sur la compréhension du mécanisme des cycles de vie de transmission, ainsi que sur l’amélioration des méthodes de diagnostic des principaux agents pathogènes des abeilles, y compris les parasites trypanosomatides. L’avènement de nouvelles techniques hydrothermales d’acides nucléiques, qui permettent l’amplification exponentielle des acides nucléiques à températures constantes, permet de détecter des agents pathogènes sans avoir besoin d’infrastructures complexes ou d’équipements de laboratoire. Dans notre domaine de l’identification et de la sélection de cibles moléculaires pour la détection d’agents pathogènes, nous utilisons la RPA isotherme combinée à CRISPR-Cas12a pour des diagnostics moléculaires rapides, sensibles et portables.

Les défis actuels comprennent l’optimisation de la sensibilité et de la spécificité d’un site, la minimisation des faux positifs, la simplification de la préparation des échantillons et le développement de rôles, déployables, diagnostiques, adaptables à divers agents pathogènes et conditions. Nous avons répondu au besoin d’une méthode rapide, simple et adaptable sur le terrain pour détecter les agents pathogènes des abeilles, en surmontant les limites des diagnostics moléculaires traditionnels. Pour commencer, procurez-vous une abeille anesthésiée.

À l’aide d’un scalpel stérile, disséquez l’abdomen de l’abeille. Transférez le tissu disséqué dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez 400 microlitres de tampon HotSHOT dans le tube, puis utilisez un pilon jetable pour faire macérer soigneusement le tissu.

Vortex le tube pour homogénéiser davantage le tissu. Ensuite, incubez le tube dans un bloc chauffant réglé à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes pour lyser les cellules. Après l’incubation, transférez immédiatement le tube sur de la glace pour qu’il refroidisse.

Neutralisez la réaction avec 400 microlitres de tris-HCL de 40 millimolaires, ce qui donne une concentration finale de 20 millimolaires de tris-HCL dans la solution. Pour l’amplification isotherme par RPA, préparez d’abord le master mix en fonction du nombre de réactions requises. Utilisez de l’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle au lieu de la lyse cellulaire prête à l’amplification pour le témoin négatif et de l’ADN pathogène pour le témoin positif.

Transférez 46,5 microlitres du mélange principal dans des tubes PCR de 0,2 millilitre. Ajoutez de l’acétate de magnésium et de l’ADN matriciel dans les capuchons de chaque tube de PCR en fonction des volumes spécifiés. Centrifugez brièvement les tubes pour les mélanger et initier la réaction RPA.

Ensuite, incubez les tubes dans un thermocycleur à 39 degrés Celsius pendant 40 minutes pour effectuer la réaction d’amplification RPA. Vous pouvez également incuber les échantillons à l’aide de tubes Eppendorf sans ADN dans un bloc thermique. Tout d’abord, préparez une solution mère d’ARN CRISPR de 100 micromolaires.

Reconstituer 10 nanomoles d’ARN CRISPR lyophilisé dans 100 microlitres d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle. Pour préparer une solution de travail d’une micromolaire, mélangez un microlitre de la pâte de 100 micromolaires avec 99 microlitres d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle dans un tube de 0,2 millilitre. Pour préparer la solution enzymatique Cas12a, diluez la solution de 100 micromolaires en une solution de travail d’une micromolaire en mélangeant un microlitre de l’enzyme avec 99 microlitres du diluant fourni dans le kit.

Maintenant, préparez une solution mère de 100 micromolaires de la sonde FAM en la remettant en suspension dans un microlitre d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle par nanomole de sonde. Pour la solution de travail de 10 micromolaires, mélangez 90 microlitres d’eau traitée au DEPC avec 10 microlitres du stock de 100 micromolaires. Ensuite, préparez le mélange réactionnel CRISPR, en excluant les amplicons dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Vortex la suspension pour bien mélanger, puis répartissez-la dans des tubes PCR. Maintenant, pipetez quatre microlitres d’amplicon RPA dans chaque tube. Placez les tubes dans un thermocycleur réglé à 37 degrés Celsius et incubez pendant 120 minutes avec une fluorescence enregistrée toutes les minutes.

Vous pouvez également incuber les échantillons à l’aide de tubes Eppendorf sans ADN dans un bloc thermique. À la fin de l’incubation, transférez les réactions dans des tubes de 0,2 millilitre pour visualisation à l’aide d’un système de documentation sur gel. Pour détecter une sonde de biotine dans un test à flux latéral, préparez les composants du test de débit dans un tube de 1,5 millilitre.

Après avoir vortex la solution, répartissez-la dans une plaque PCR. Ajoutez ensuite quatre microlitres d’amplicon dans les puits respectifs. Incuber les tubes PCR à 37 degrés Celsius pendant 120 minutes à l’aide d’un thermocycleur ou d’un bloc thermique sans lecture de fluorescence.

Transférez ensuite les échantillons dans des tubes de 0,2 millilitre. Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon de fonctionnement et 10 microlitres du mélange réactionnel dans chaque tube. Insérez les ImmunoStrips et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.

Lisez les résultats après 10 minutes d’immersion. L’amplification par polymérase recombinase a détecté Lotmaria passim dans 16 des 32 échantillons d’abeilles, tandis que l’amplification en chaîne quantitative par polymérase n’a identifié que 12 positifs, démontrant une sensibilité plus élevée de la méthode RPA. La limite de détection de la réaction en chaîne quantitative par polymérase était d’environ 9,6 parasites, comme le montre la courbe d’amplification avec le signal visible le plus bas.

La limite de détection de l’amplification de la polymérase recombinase couplée à CRISPR-Cas12a correspondait à celle de QPCR, détectant aussi peu que six picogrammes correspondant à 96 parasites.