Évaluation de l’effet des facteurs SASP sur la prolifération des cellules cancéreuses à l’aide d’une analyse comparative de trois méthodologies distinctes

Les cellules cancéreuses sénescentes sécrètent ces facteurs qui influencent les cellules voisines. Nous présentons trois modèles in vitro pour étudier les effets paracrines et juxtacrines pilotés par le SASP sur la prolifération des cellules HeLa, la surveillance en temps réel de l’impédance et l’imagerie cellulaire vivante permettant une analyse dynamique, cinétique et morphologique, révélant des effets paracrines sénescents et microenvironnementaux au-delà des tests d’endpoint traditionnels. Pour commencer, allumez le système d’analyse cellulaire en temps réel avant l’ensemencement des cellules.

Lancez le logiciel RTCA version 2.0. Cliquez sur le bouton X notes et entrez les détails expérimentaux. Cliquez sur le bouton Planifier et ajoutez deux étapes pour enregistrer le fond et surveiller la prolifération cellulaire toutes les 15 minutes pendant 72 heures.

Choisissez la première étape et cliquez sur Lecture. Ajoutez manuellement 50 microlitres de milieu complet à chaque puits de la vue e-plate. Ensuite, lavez les cellules HeLa sénescentes et non sénescentes avec cinq millilitres de PBS stérile préchauffé.

Après l’aspiration, ajoutez un millilitre de trypsine préchauffée à 0,05 % et incubez. Neutralisez la trypsine avec cinq millilitres de DMEM complet supplémenté en antibiotiques. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 G à température ambiante pendant 10 minutes.

Après avoir éliminé le surnageant, re-suspendez les granulés cellulaires dans cinq millilitres de DMEM complet complétés par antibiotiques. Maintenant, séminez des cellules HeLa non sénescentes dans chaque puits d’une vue e-plate sur 100 microlitres de DMEM complet supplémenté en antibiotiques. Placez la vue de la plaque électronique dans le berceau du système d’analyse cellulaire en temps réel afin de permettre aux cellules de s’attacher à la surface de la plaque dans l’incubateur.

Choisissez la deuxième étape et cliquez sur Lecture pour commencer la mesure de l’impédance. Les cellules de graines dans la plaque électronique insèrent des puits contenant 60 microlitres de DMEM complet supplémenté en antibiotiques sous trois configurations expérimentales différentes. Maintenez l’insert de la plaque électronique à 37 degrés Celsius dans un incubateur contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant six heures pour l’attachement.

Cliquez sur pause après six heures de mise en œuvre cellulaire, puis aspirez doucement le milieu de culture de chaque puits de la vue de la plaque électronique pour retirer les cellules sériques et non adhérentes. Laver les puits deux fois avec du PBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Ajoutez 140 microlitres de DMEM sans sérum à chaque puits de la vue de la plaque électronique.

Retirez le médium. Lavez les puits d’insert en plaques électroniques avec PBS, puis ajoutez 60 microlitres de DMEM sans sérum. Maintenant, positionnez l’insert de la plaque électronique dans la vue de la plaque électronique.

Appuyez doucement jusqu’à ce que l’insert soit complètement ensemencé dans le puits. Insérez la plaque combinée dans le système d’analyse cellulaire en temps réel. Cliquez sur Play pour reprendre la surveillance en temps réel des valeurs de l’index cellulaire à des intervalles de 15 minutes via le logiciel.

Normaliser les valeurs de l’indice des cellules au moment où la vue de la plaque électronique et l’insertion de la plaque électronique sont combinées et insérées dans le système d’analyse des cellules en temps réel. Ensuite, appuyez sur le bouton Analyse des données pour calculer le taux et la quantité de prolifération en utilisant les données d’indice et de pente maximales des cellules obtenues par le système d’analyse cellulaire en temps réel. Ensuite, analysez les données à l’aide d’un programme statistique approprié.

Aspirez le milieu de culture à partir des deux plaques à six puits contenant les cellules HeLa sénescentes et non sénescentes. Lavez les cellules deux fois avec du PBS préchauffé à 37 degrés Celsius pour éliminer les résidus sériques et les débris cellulaires. Ajoutez deux millilitres de milieux DMEM sans sérum et supplémentés en antibiotiques dans chaque puits, puis incubez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.

Collectez les milieux conditionnés de chaque puits dans des tubes stériles dans une armoire de sécurité laminaire. Centrifugez le milieu conditionné collecté à 1000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour retirer les débris cellulaires, suivi d’une centrifugation à 10 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir le surnageant clarifié. Ensuite, centrifugez le milieu conditionné à l’aide d’unités ultra-centrifuges de deux millilitres à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes à 3000 g pour le concentrer à 400 microlitres.

Diluez le concentré obtenu avec un milieu frais sans sérum pour préparer 1x, 2x et 3x milieux conditionnés concentrés dans des tubes stériles dans une cabine de sécurité laminaire. Lorsque les cellules se sont attachées, aspirez doucement le milieu de culture de chaque puits de la vue de la plaque électronique pour éliminer les cellules sériques et non adhérentes et laver avec du PBS. Ensuite, une pipette de 200 microlitres a préchauffé les milieux conditionnés collectés à 37 degrés Celsius dans chaque groupe.

Insérez la vue e-plate dans le système d’analyse cellulaire en temps réel et cliquez sur Lecture pour reprendre la surveillance en temps réel des valeurs de l’index cellulaire toutes les 15 minutes pendant 48 heures. Placez les cellules de graines sur une microlama sous trois installations expérimentales et incubez à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone. Après huit heures d’attache, lavez les cellules deux fois avec du PBS préchauffé à 37 degrés Celsius.

Ajoutez 200 microlitres de Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium sans sérum dans chaque puits. Allumez le contrôleur de température 2002-2 et réglez-le à 37 degrés Celsius. Allumez le contrôleur CO2 2000 et réglez-le à 5 % de dioxyde de carbone.

Allumez la source lumineuse à fluorescence. Placez la lame sur la chambre d’incubation sur le dessus de la scène. Lance le logiciel sur l’ordinateur.

Sélectionnez l’objectif 20x. Ajoutez le canal de contraste de phase et le canal FITC de fluorescence. Avec le contrôleur de scène, marquez les positions pour chaque emplacement.

Fixez l’intervalle de temps à 30 minutes et la durée de l’acquisition à 48 heures, puis lancez l’acquisition. Comptez les cellules positives à la protéine fluorescente verte aux deux moments et calculez le pourcentage d’augmentation pour analyse. Le traitement par doxorubicine a induit significativement la sénescence cellulaire dans les cellules HeLa.

La quantification des cellules SA-bêta-gal-positives a montré un pourcentage significativement plus élevé dans le groupe traité à la doxorubicine par rapport au groupe témoin. Dans la première approche, les cellules HeLa non sénescentes, co-cultivées avec des cellules HeLa sénescentes, présentaient un taux de prolifération et une capacité significativement accrus par rapport aux cellules co-cultivées avec des cellules HeLa non sénescentes. Les milieux conditionnés dérivés de cellules HeLa sénescentes à des concentrations 2x et 3x augmentaient significativement le taux de prolifération et la capacité des cellules HeLa non sénécentes par rapport aux milieux conditionnés provenant de cellules non sénescentes.

Dans la troisième approche, après 48 heures de co-culture, les cellules HeLa positives à GFP ont montré une augmentation significativement plus importante de la prolifération lorsqu’elles étaient co-cultivées avec des cellules HeLa sénescentes comparées aux contrôles non sénescents en co-culture ou uniquement à GFP.