Révéler le contrôle électromécanique de l’homéostasie tissulaire à l’aide d’un dispositif microfluidique à deux couches

Nous appliquons des champs électriques contrôlés pour étudier comment les tissus réagissent aux signaux électriques, en nous concentrant sur la façon dont les courants ou les champs régulent l’adhésion, la prolifération et l’extrusion cellulaires, affectant ainsi l’homéostasie tissulaire. Nous avons découvert que la direction des courants physiologiquement pertinents dicte les états tissulaires. Le champ apical à basal induit un phénotype prolifératif, tandis que le champ basal à apical favorise l’extrusion cellulaire, permettant la modulation de la densité cellulaire globale.

Alors que les études bioélectriques quantitatives se sont longtemps concentrées sur la migration par gravitaxie, l’homéostasie tissulaire reste inaccessible. Notre système permet désormais d’étudier directement comment les cartons physiologiques régulent l’organisation et l’entretien des tissus. Notre protocole intègre la microfluidique, la stimulation électrique des tissus, la microscopie de structure et de force, et l’imagerie en direct pour étudier le contrôle électromécanique de l’homéostasie tissulaire.

Nos travaux ont révélé des règles de couplage électromécaniques de base. Avec de nouveaux outils, nous pouvons maintenant explorer comment les motifs bioélectriques natifs émergent et régulent les tissus et si nous pouvons contrôler le comportement des tissus complexes en ajustant ces signaux électromécaniques. Pour commencer, placez une couche propre d’un moule en polydiméthylsiloxane ou PDMS, face vers le haut sur un capuchon de plat en plastique propre et ajoutez lentement 500 microlitres d’adhésif liquide durcissable aux ultraviolets sur le moule.

À l’aide d’une spatule, mouillez soigneusement toutes les structures saillantes et éliminez les bulles d’air formées pendant le processus de mouillage. Appuyez doucement une lamelle sur le moule PDMS et utilisez un essuie-glace de laboratoire pour enlever tout excès d’adhésif durcissable aux ultraviolets, en veillant à ce que la face supérieure de la lamelle reste propre et plate. Durcissez partiellement la structure sous une lumière ultraviolette uniformément éclairée avec une longueur d’onde comprise entre 363 et 370 nanomètres.

Essuyez toutes les marques avec de l’éthanol à 75 %. Ensuite, tenez fermement la structure sur une surface plane et décollez lentement le moule PDMS de la couche durcie. Ensuite, placez une couche propre de deux moules PDMS face vers le bas sur une dalle PDMS plate de plus de 2,5 millimètres d’épaisseur.

Tapotez doucement les éléments du moule par le haut à l’aide d’une pince à épiler. Observez l’interface sous les caractéristiques d’assombrissement ou de contraste optique, ce qui confirme un bon contact. Maintenant, remplissez l’espace entre le moule PDMS et la dalle avec un adhésif liquide durcissable aux ultraviolets par capillarité.

Durcissez partiellement la structure sous la lumière ultraviolette pendant 10 secondes, comme démontré précédemment. À l’aide d’une pince à épiler rembourrée douce, décollez délicatement la couche adhésive composite durcissable aux ultraviolets et le moule PDMS de la dalle PDMS. Si nécessaire, coupez les bords excédentaires de la couche adhésive durcie avec des ciseaux bien aiguisés.

Ensuite, placez la première couche attachée à une lamelle de verre rectangulaire sur une surface plane. Alignez la couche deux, toujours attachée à son moule PDMS, avec la couche un et appuyez fermement sur les deux couches jusqu’à ce que des ombres apparaissent sous les entités. Faites durcir la structure alignée sous la lumière ultraviolette pendant 10 secondes pour lier les couches un et deux dans une puce microfluidique à deux couches, puis décollez doucement le moule PDMS de la puce collée.

Pipeter immédiatement 10 microlitres de solution de précurseur de gel de polyacrylamide sur le milieu de la région tissulaire directement au-dessus de la fente de la deuxième couche. Appuyez doucement sur une lamelle ronde en verre de 10 millimètres de diamètre sur la gouttelette pour former un gel plat. Observez la solution de gel s’écouler dans la première couche à travers la fente et arrêtez-vous à la rangée de piliers de barrière.

Durcissez immédiatement la puce microfluidique assemblée sous lumière ultraviolette pendant cinq minutes. Ensuite, laissez la puce intacte pendant environ une heure pour permettre au gel de polyacrylamide de se solidifier complètement. Ensuite, incubez la puce microfluidique dans un tampon HEPES 0,1 molaire à pH 7,4 pendant au moins une heure pour hydrater le gel et réduire l’adhérence entre le gel et la lamelle.

Ensuite, utilisez doucement une pince à épiler pointue pour retirer la lamelle de la surface du gel. Placez une cartouche en polycarbonate de qualité médicale sur une surface plane avec le bas vers le haut et alignez une puce séchée face vers le bas avec la cartouche. Pipetez l’adhésif durcissable aux UV dans les crevasses entre la puce et la cartouche, en les remplissant par effet capillaire, et faites-le durcir sous la lumière UV.

Stérilisez les dispositifs microfluidiques fabriqués en les plaçant sous une lumière ultraviolette à 200 à 280 nanomètres à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité. Préparez le volume requis de 50 microgrammes par millilitre de collagène, une solution de travail dans 1X DPBS sur de la glace. Sur glace, préparez la solution de travail Sulfo-SANPAH en diluant deux microlitres de solution mère Sulfo-SANPAH, préalablement dissoute dans du diméthylsulfoxyde anhydre dans 80 microlitres de tampon HEPES froid 0,1 molaire à pH 7,4 stocké à quatre degrés Celsius.

Tamponnez les bords du gel de polyacrylamide avec des lingettes de laboratoire pour le sécher à l’intérieur de l’appareil. Pipetez 80 microlitres de solution de travail Sulfo-SANPAH sur la surface du gel, en assurant une immersion totale, et placez la puce sous la lumière ultraviolette pendant cinq minutes pour activer le Sulfo-SANPAH. Rincez le gel trois fois avec un tampon HEPES froid de 0,1 molaire à pH 7,4.

Répétez le traitement Sulfo-SANPAH en pipetant 80 microlitres de solution de travail SS sur le gel et en l’irradiant sous lumière ultraviolette pendant cinq minutes. Cette fois, rincez le gel trois fois avec du 1X DPBS froid. Enfin, pipetez 100 microlitres de collagène une solution sur le gel de polyacrylamide, en assurant une couverture complète, et laissez-le pendant une heure.

Rincez trois fois le collagène non attaché avec 1X DPBS, puis maintenez le gel immergé dans 1X DPBS jusqu’à ce que vous l’utilisiez à nouveau. Fixez les appareils aux inserts à l’aide de vis. Ensuite, fixez jusqu’à quatre ensembles d’inserts de dispositif sur le support conçu pour être monté sur une platine de microscope.

Ajoutez deux millilitres de milieu de culture dans chaque puits principal des appareils et à travers les canaux d’élimination des déchets pour rincer et remplacer le 1X DPBS. Ensuite, insérez les électrodes de platine dans le tube contenant 45 millilitres de fluide, en vous assurant qu’elles sont complètement immergées dans le fluide. Tirez le milieu de culture à travers le tube Tygon à l’aide d’une seringue et fixez-le fermement.

Connectez une extrémité du tube rempli de fluide à la chambre d’électrode et l’autre extrémité à l’appareil. Maintenant, préparez une suspension cellulaire en suivant les recommandations de trypsinisation ou de préparation de la suspension cellulaire et ensemencez 0,1 million de cellules dans le puits principal. Montez l’installation sur le microscope avec les chambres d’électrodes sur les côtés et connectez le compteur de source à la chambre d’électrode.

Utilisez trois appareils avec une résistance de canal identique. Attribuez-en un en tant que groupe de contrôle. Appliquez un courant apical à basal au deuxième appareil et un courant basal à apical au troisième appareil.

Source un signal électrique en mode pince de courant et fournir un courant total de 20 microampères. Choisissez un objectif 20X pour l’imagerie des tissus entiers avec un microscope à épifluorescence. Enfin, choisissez le canal 561 pour les canaux de fluorescence rouge et de fond clair.

Sélectionnez un intervalle de temps d’une heure pendant l’imagerie longue durée. Une stimulation électrique a été appliquée perpendiculairement aux cellules pour perturber le potentiel transépithélial afin d’étudier son rôle dans le comportement des tissus sous différentes directions de courant. Sous l’imagerie à contraste de phase, les courants apicaux à basaux, ou ATB, ont provoqué l’éclaircissement des jonctions cellulaires dans les 10 minutes suivant l’application, tandis que les conditions de contrôle et basales à apicales, BTA, ont montré un faible contraste et des surfaces apicales planes.

Les courants ATB produisaient une convexité vers l’extérieur à la surface de la cellule apicale. La déformation du gel était fortement dépendante de la direction du courant. Les courants ATB tiraient le gel vers le haut, tandis que les courants BTA comprimaient le gel vers le bas.

L’intensité de l’E-cadhérine jonctionnelle a augmenté sous les courants BTA, mais a diminué de manière significative sous les courants ATB par rapport au contrôle. L’intensité de l’actine jonctionnelle diminuait sous les courants ATB, mais n’augmentait pas significativement sous les courants BTA par rapport au contrôle. Les courants ATB ont déclenché des extrusions de cellules vivantes multicellulaires à travers la monocouche, tandis que les courants BTA ont préservé la structure de la monocouche, similaire au contrôle.

L’hétérogénéité spatiale de la distribution cellulaire était significativement plus élevée sous les courants ATB, mais restait faible et uniforme dans des conditions BTA et de contrôle. Les taux de prolifération cellulaire ont augmenté sous la stimulation ATB, avec des taux de division plus élevés au fil du temps. En revanche, les courants BTA ont induit plus d’événements de mort cellulaire.