Dissection des tissus craniofaciaux du poisson-zèbre lors de la coloration au bleu d’Alcian

Nous explorons les mécanismes par lesquels le palais du poisson zèbre se développe au fil du temps à l’aide d’échantillons fixes ainsi que l’imagerie en accéléré d’embryons à haute résolution spatiale temporelle à l’aide de la microscopie à feuillet de lumière. Notre protocole est simple et facile à suivre. Il établit des étapes détaillées pour disséquer et séparer les cartilages craniofaciaux d’une larve de poisson-zèbre âgée de cinq jours.

Ce protocole a permis une caractérisation minutieuse de la forme du palais à l’échelle tissulaire et cellulaire, ce qui nous a permis d’évaluer l’effet des antigènes commentateurs sur la morphogenèse du palais. Pour commencer, prélevez 20 à 25 larves de poisson-zèbre anesthésiées, et retirez l’anesthésique une fois que les larves ont cessé de bouger. Ajoutez 1,5 millilitre d’aldéhyde paraforme à 4 % dans le tube et placez l’échantillon sur une bascule réglée à 60 tours par minute à température ambiante pendant deux heures.

À l’aide d’une pipette, retirez la plus grande quantité possible de fixateur du tube. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre d’éthanol à 50 % à l’échantillon et placez-le sur une bascule à température ambiante réglée à 60 tours par minute pendant 10 minutes. Maintenant, à l’aide d’une pipette, aspirez l’éthanol du tube et ajoutez 1,5 millilitre de solution de coloration au bleu d’alcian à l’échantillon.

Incuber les larves dans la solution de coloration pendant 18 à 20 heures à température ambiante tout en se balançant à 60 tours par minute. Ensuite, retirez la solution de teinture à l’aide d’une pipette et lavez les larves avec 1,5 millilitre d’eau distillée pendant une à deux minutes sur une bascule à température ambiante. Ajoutez ensuite un millilitre de solution d’eau de Javel à l’échantillon et incubez à température ambiante pendant 20 minutes sans couvrir les tubes.

À l’aide d’une pipette, retirez la solution d’eau de Javel de l’échantillon et traitez l’échantillon avec les solutions de clarification des tissus un et deux. Après avoir retiré la deuxième solution, ajoutez 1,5 à deux millilitres de solution de stockage à l’échantillon. En raison de la teneur en glycérol, observez comment les échantillons colorés coulent progressivement au fond dans les 10 minutes.

Placez une larve tachée sur sa face latérale dans la boîte de Pétri recouverte d’agarose. À l’aide d’une pince, grattez doucement le jaune du corps des larves. Après l’élimination du vitell, transférez les larves dans une boîte de Pétri fraîche pour éviter toute interférence pendant la dissection, tenez les larves près de l’arrière de la tête à l’aide d’une paire de pinces.

Avec une autre paire, retirez soigneusement les yeux sans endommager les structures faciales crâniennes environnantes. Tout en tenant la larve, toujours avec une paire de pinces, faites une incision au centre du tissu dorsal du neuro crâne. Ensuite, pincez et retirez le cerveau et les tissus associés.

Ensuite, séparez la tête des larves du reste du corps. La région de la tête résultante doit inclure le neurocrâne et le crâne viscéral encore attaché aux extrémités antérieure et postérieure. Coupez soigneusement les deux points de connexion entre le neurocrâne et le crâne viscéral avec une pince pour les séparer complètement.

Enfin, placez une ou deux gouttes de glycérol à 100 % sur une lame de verre propre et transférez le neurocrâne ou le crâne viscéral disséqué sur la lame. À l’aide d’une pince, placez délicatement une lamelle sur les mouchoirs en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit emprisonnée, et scellez la lamelle avec du vernis à ongles avant l’imagerie. Le neurocrâne disséqué présentait plusieurs structures clairement étiquetées, notamment la plaque ethmoïde, la trabécule et le cartilage péricardique, permettant une analyse structurelle détaillée.

Le crâne viscéral comprenait le cartilage de Meckel et des éléments supplémentaires tels que le carré du palato et les cartilages basilicaux. La coloration au bleu d’Alcian cinq jours après la fécondation a permis une visualisation claire de la plaque ethmoïde. La largeur et la longueur de la plaque ethmoïdale étaient systématiquement mesurables à l’aide de l’analyse d’images, et la longueur était significativement supérieure à la largeur, et les données quantifiées de 15 échantillons ont été quantifiées.

La surface de la plaque ethmoïdale a été extraite à partir de données d’image, et confirmée par quantification avec des marques de limites claires. Des arrangements cellulaires distincts ont été observés dans la plaque ethmoïdale avec des cellules cuboïdes dans la région médiale et des cellules columères dans les parties latérales. La coloration Dappy a permis de visualiser les noyaux cellulaires individuels à l’intérieur de la plaque ethmoïdale.