Mutagenèse basée sur CRISPR-Cas9 dans le nématode entomopathogène Steinernema hermaphroditum et le maintien des lignées mutantes
30 décembre 2025
Cet article démontre l’ingénierie du génome médiée par CRISPR-Cas9 chez Steinernema hermaphroditum, un nématode entomopathogène (EPN : parasite insecte) et un modèle génétique émergent. La technologie décrite est utile pour créer des mutants, permettant d’élucider les fonctions géniques en biologie des nématodes pertinentes pour la symbiose mutualiste et parasitaire.
Nous travaillons sur la génétique de la symbiose bactérienne nématode, qui a des applications agricoles. Les outils génétiques chez la bactérie Xenorhabdus sont très bien développés, mais la génétique de l’EPN reste limitée, reposant principalement sur des tests d’ARN et EMS. Pour commencer, obtenez des plaques d’agar au nématode semées de Xenorhabdus griffiniae et Comamonas aquaticus.
Sélectionnez des nématodes Steinernema hermaphroditum sur les plaques NGM préparées contenant Xenorhabdus griffiniae. Couve-les à 25 à 28 degrés Celsius pour une croissance optimale. La veille de la microinjection, choisissez des hermaphrodites de stade J3 sur des plaques d’agar NGM fraîches semées de Xenorhabdus griffiniae.
Le jour de la microinjection, choisissez de jeunes hermaphrodites adultes pour l’injection. Extraire la séquence du gène cible du génome de référence Steinernema hermaphroditum à l’aide de BlastP. Sélectionnez un exon codant précoce, de préférence le premier exon, et entrez la séquence dans CRISPRscan en utilisant les paramètres par défaut pour générer des ARN CRISPR candidats.
Bombardez les principaux ARN candidats CRISPR contre le génome de Steinernema hermaphrodit pour éviter les correspondances hors cible. Stockez les ARN CRISPR sélectionnés et les ARN CRISPR trans-activants universels à 100 micromolaires chacun dans un tampon duplex à moins 80 degrés Celsius. Faites fondre du 2 % d’agarose dans de l’eau au micro-ondes.
Transférez 50 microlitres d’agarose fondu sur un verre de recouvrement. Couvre-le immédiatement avec un second verre de couverture. Après un séchage de 20 minutes, retirez la vitre supérieure du couvercle, puis identifiez la face avant du tampon d’agarose.
Conservez les tampons d’agarose à température ambiante pour une utilisation prolongée pendant des mois à des années. Pour préparer les aiguilles à l’injection, retirez des capillaires de quartz sur un extracteur de filament laser et stockez les aiguilles dans une boîte de stockage pour pipettes. Préparez de nouveaux duplex d’ARN-guide en mélangeant les crRNA sélectionnés et les ARN CRISPR trans-activants universels dans un rapport un pour un.
Incubez le tube à 94 degrés Celsius pendant deux minutes, puis refroidissez à température ambiante pour recouvrir les duplex. Assemblez le mélange d’injection en combinant Cas9, chlorure de potassium et les duplex gRNA, puis incubez. Faites tourner le tube PCR trois fois pour mélanger, puis faites tourner brièvement pendant 10 à 15 secondes dans une mini-centrifugeuse.
Après le dernier mélange, faites tourner jusqu’à une minute pour recueillir le contenu. Ensuite, utilisez une embout microchargeur pour charger un à deux microlitres de mélange d’injection dans l’aiguille. Montez l’aiguille sur le porte-aiguille, ouvrez la pointe en la faisant glisser sur du ruban adhésif double face sous de l’huile d’halocarbone.
Et testez la taille de l’ouverture en utilisant la fonction « clean » du micro-injecteur. Placez une petite goutte d’huile d’halocarbone sur le tampon à 2 % d’agarose. À l’aide d’un microscope disséquant et d’un fil de platine souple, prenez un jeune hermaphrodite adulte.
Lavez-le dans un tampon M9 pour éliminer les bactéries. Transférez le nématode sur un coussinet d’agarose, et placez-le dans une gouttelette d’huile d’halocarbone. Utilisez le fil de platine doux pour brosser doucement le nématode jusqu’à ce qu’il soit immobilisé.
Montez la plaque sur l’étage de microinjection. Localiser un bras gonadal et le percer avec l’aiguille. Utilisez la fonction « clean » de l’injecteur pour délivrer le mélange d’injection à 99 livres par pouce carré jusqu’à ce que le flux gonadique soit visible, confirmant ainsi l’accès du réactif au syncytium.
Si possible, repositionnez l’étage et injectez le second bras gonadal de la même manière. Immédiatement après l’injection, resuspendez l’animal injecté dans un à deux microlitres de tampon M9 sur le tampon d’agarose. Utilisez un fil de platine fin pour retirer le ver injecté sur la plaque, puis lavez l’huile avec un tampon M9, et réposez-le sur la plaque NGM de récupération ensemée de Comamonas aquatica.
Incubez la plaque de récupération à 25 degrés Celsius toute la nuit. Le lendemain, isolez chaque nématode P0 injecté sur des plaques NGM individuelles semées de Xenorhabdus griffiniae. Deux ARN CRISPR ont été conçus pour cibler l’homologue Steinernema hermaphrodit de l’unc-22 sur des sites PAM précédemment publiés.
L’analyse par bruit des nématodes exposés à la nicotine a montré des différences nettes de mouvement entre les mutants UNC-22 et les nématodes de type sauvage. Le génotypage des progénitus en contraction par PCR a révélé plusieurs bandes faibles au site cible pour Pam 3 et Pam 5. Le séquençage a confirmé les événements d’insertion et de suppression sur le site UNC-22 ciblé.
Mon laboratoire a élargi mon travail postdoctoral en génétique des NPE. CRISPR est désormais disponible dans trois espèces de Steinernema. Dans ce protocole, nous avons mis en place une technique efficace pour créer des mutants stables et héréditaires en utilisant l’édition génique CRISPR-Cas9.
Avec une édition génétique stable de CRISPR-Cas9, nous pouvons disséquer les mécanismes moléculaires derrière la symbiose Steinernema-Xenorhabdus.
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Aperçu
Cet article démontre l'ingénierie du génome par CRISPR-Cas9 chez Steinernema hermaphroditum, un nématode entomopathogène et un modèle génétique émergent. Cette technologie est utile pour créer des mutants afin d'élucider les fonctions des gènes dans la biologie des nématodes, en lien avec les symbioses mutualistes et parasitaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génétique
- Microbiologie
- Entomologie
Contexte
- CRISPR-Cas9 est un outil puissant pour l'édition du génome.
- Steinernema hermaphroditum sert d'organisme modèle pour l'étude des nématodes.
- La compréhension des fonctions des gènes peut fournir des informations sur les relations symbiotiques.
- Les nématodes entomopathogènes sont importants pour la lutte biologique contre les ravageurs.
Objectif de l'étude
- Démontrer l'application de CRISPR-Cas9 chez les nématodes.
- Créer des mutants pour l'analyse fonctionnelle des gènes.
- Explorer la base génétique des interactions mutualistes et parasitaires.
Méthodes utilisées
- Techniques d'édition du génome par CRISPR-Cas9.
- Génération et caractérisation de mutants.
- Analyse de la fonction des gènes en biologie des nématodes.
- Évaluation des comportements symbiotiques et parasitaires.
Résultats principaux
- Application réussie de CRISPR-Cas9 chez Steinernema hermaphroditum.
- Création de mutants viables présentant des fonctions géniques modifiées.
- Éclairages sur les mécanismes génétiques sous-jacents aux relations symbiotiques.
- Implications potentielles pour les stratégies de lutte contre les ravageurs.
Conclusions
- Le CRISPR-Cas9 est efficace pour l'ingénierie du génome chez les nématodes.
- Les mutants fournissent des informations précieuses sur les fonctions des gènes.
- Cette recherche améliore la compréhension de la biologie des nématodes et de ses applications.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'édition du génome basée sur CRISPR-Cas9 chez Steinernema hermaphroditum permet une interrogation génétique précise des mécanismes mutualistes et parasitaires chez les nématodes entomopathogènes. Cette plateforme soutient la validation fonctionnelle des cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte, avec des implications directes pour la recherche translationnelle en biotechnologie agricole et écologique. La capacité à générer et à maintenir des lignées mutantes stables accélère la recherche et développement orientée par des hypothèses ainsi que le tri des portefeuilles pour de nouvelles cibles bioactives.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une disruption ciblée de gènes afin d'élucider les voies biologiques sous-jacentes aux interactions nématode-hôte et nématode-bactérie.
- Permet la validation fonctionnelle de gènes candidats impliqués dans la mutualité et le parasitisme.
- Facilite la détection mécanistique des risques en générant des phénotypes observables liés à des modifications génétiques spécifiques.
- Améliore la confiance prédictive dans le choix et la priorisation des cibles en aval.
Développement de criblages et de tests
- Offre un système génétiquement manipulable pour développer et valider des tests phénotypiques chez les nématodes.
- Permet la génération reproductible de lignées mutantes pour des protocoles de criblage standardisés.
- Facilite l'évaluation quantitative de la fonction des gènes grâce à des paramètres phénotypiques observables.
- Accélère le développement des tests en exploitant la reproduction hermaphrodite pour établir rapidement des lignées homozygotes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet d'associer la manipulation génétique à des modèles pertinents pour les maladies dans la recherche sur la lutte contre les ravageurs agricoles.
- Permet une continuité allant de la découverte des gènes à la validation fonctionnelle dans des systèmes écologiquement pertinents.
- Facilite l'avancement ajusté aux risques des cibles bioactives pour des applications translationnelles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette plateforme CRISPR-Cas9 établit S. hermaphroditum comme un modèle polyvalent pour la découverte précoce jusqu'à la validation préclinique en biologie des nématodes et en recherche sur les symbioses.
- Biologie de la découverte : Facilite le test d'hypothèses et la clarification des voies biologiques par mutagenèse ciblée et validation phénotypique.
- Écrans génétiques : Fournit des lignées mutantes reproductibles pour la standardisation des tests et des mesures quantitatives.
- Analytique : Permet la mesure des phénotypes observables, tels que le phénotype de contraction, afin de comparer la fonction des gènes dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la découverte fondamentale et la recherche préclinique dans les modèles de lutte contre les ravageurs et de symbiose.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place un jeu d'outils génétiques réutilisable pour des études continues de génomique fonctionnelle chez les NPE et les espèces apparentées.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études sur la fonction des gènes.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles standardisés, évolutifs et reproductibles de manipulation génétique.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller/arrêt et d'investir de manière efficiente en R&D dans de nouvelles cibles.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, de cibles génétiques pour des applications agricoles et écologiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microinjection et en techniques d'édition du génome par CRISPR-Cas9.
- Suppose l'accès à un équipement de microinjection et à une infrastructure en biologie moléculaire.
- Exige une standardisation entre équipes pour l'entretien des lignées mutantes et la validation phénotypique.
- L'adaptation à d'autres espèces de NPE peut nécessiter une optimisation du protocole.
- La validation phénotypique dépend de paramètres observables et quantifiables, tels que le phénotype de soubresauts musculaires.
