Name: Mutagenèse basée sur CRISPR-Cas9 dans le nématode entomopathogène Steinernema hermaphroditum et le maintien des lignées mutantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Découvrez la mutagenèse CRISPR-Cas9 chez Steinernema hermaphroditum pour l'ingénierie génomique des nématodes entomopathogènes. Cette méthode permet de créer des mutants et d'étudier les fonctions géniques impliquées dans la symbiose.

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<ol><li>Stock, S., Blair, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Murfin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nematode-bacterium+symbioses--cooperation+and+conflict+revealed+in+the+%26%2334%3Bomics%26%2334%3B+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bull%22%5BJournal%5D)">Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the &#34;omics&#34; age.</a> Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).</li>
<li>Dillman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+nematode+by+any+other+name%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic nematode by any other name.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).</li>
<li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), iyab170(2022).</li>
<li>Sergeant, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+typing%2C+and+insecticidal+activity+of+Xenorhabdus+isolates+from+entomopathogenic+nematodes+in+United+Kingdom+soil+and+characterization+of+the+xpt+toxin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).</li>
<li>Walsh, K. T., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+microbial+populations+in+Steinernema+%28Steinernematidae%2C+Nematoda%29+infected+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae.</a> J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+The+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).</li>
<li>Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nematode+age+and+culture+conditions+on+morphological+and+physiological+parameters+in+the+bacterial+vesicle+of+Steinernema+carpocapsae+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae).</a> J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).</li>
<li>Cao, M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready+or+Not%3A+Microbial+adaptive+responses+in+dynamic+symbiosis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments.</a> J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).</li>
<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+pathogens+as+biological+control+agents%3A+Back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).</li>
<li>Campos-Herrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspecific+virulence+of+entomopathogenic+nematodes+against+the+pests+Frankliniella+occidentalis+%28Thysanoptera%3A+Thripidae%29+and+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nematol%22%5BJournal%5D)">Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+toolbox+for+Photorhabdus+and+Xenorhabdus%3A+pSEVA+based+heterologous+expression+systems+and+CRISPR%2FCpf1+based+genome+editing+for+rapid+natural+product+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling.</a> Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).</li>
<li>Ratnappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+knockdown+by+microinjection+in+the+model+entomopathogenic+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).</li>
<li>Cao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+editing+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+genetically+manipulating+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes.</a> J Vis Exp. (181), e63885(2022).</li>
<li>Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterisation+of+Steinernema+hermaphroditum+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Steinernematidae%29%2C+an+entomopathogenic+nematode+from+Indonesia%2C+and+its+phylogenetic+relationships+with+other+members+of+the+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus.</a> Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).</li>
<li>Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Steinernema+hermaphroditum+%28Nematoda%2C+Rhabditida%29%2C+from+West+Uttar+Pradesh%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India.</a> Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).</li>
<li>Schwarz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+and+its+associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+stable+intercellular+bridges+formed+by+incomplete+cytokinesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development.</a> Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+for+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Sci Rep. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Culp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+nematode+Caenorhabditis+briggsae+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system.</a> Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).</li>
<li>Hellekes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+gene+editing+in+non-model+nematode+Panagrolaimus+sp.+PS1159%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159.</a> Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).</li>
<li>Patel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+stable+transgenic+lines+in+the+human-infective+nematode+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis.</a> G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+Designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genome+editing+strategy+to+generate+putative+null+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9.</a> G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+Edits+from+Sanger+Trace+Data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> J Vis Exp. (91), e52096(2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+co-CRISPR+strategy+for+efficient+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).</li>
<li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora%3A+A+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).</li>
<li>Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+A+new+tool+for+the+study+and+control+of+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites.</a> Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).</li>
<li>Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+parasitic+helminths%3A+A+brief+history+and+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).</li>
<li>Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+peroxidase+gene+controlling+body+size+in+the+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum.</a> Genetics. 226 (2), (2024).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar (maille 80-100)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26411</td><td>Également utilisé dans les plaques de pyruvate LB</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td>Également utilisé en génotypage</td></tr><tr><td>ARN-trace CRISPR-Cas9 Alt-R</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase Alt-R S.p. Cas9 V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles borosilicates</td><td>Instrument de Précision Mondial</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol & nbsp ;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>5 mg/mL d’éthanol</td></tr><tr><td>Comamonas aquatica (DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture pour le tampon d’agarose</td><td>Laboratoires de recherche sur le cerveau</td><td>#4860-1D</td><td>Épaisseur NO1 de 48 x 60 mm</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>Nettoyage ADN et Concentrateur-5&nbsp ;</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4x microinjecteur avec set de tête de poignée, porte-aiguille taille 4 0</td><td>Eppendorf/Calibre</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Larves de 5e stade de Galleria melonella</td><td>GrubCo</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>Système d’imagerie sur gel</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de charge en gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine (2 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>Amorces de génotypage : DNA oligo, 25 nmol</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>Également utilisé dans les plaques Dark LB, LB Pyruvate & nbsp ;</td></tr><tr><td>Extrait de levure Gibco Bacto</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>Également utilisé dans les plaques Dark LB, LB Pyruvate & nbsp ;</td></tr><tr><td>Jeu de tête de poignée 4 porte-aiguilles taille 1</td><td>Calibre</td><td>EPE-5196083008</td><td>(associé à l’aiguille borosilicate 1B120F-4)</td></tr><tr><td>Huile d’halocarbone 700</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Crochet à vis à fil dur de platine pour l’entretien quotidien</td><td>Recherche Tritech</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>Inférence des modifications CRISPR (ICE)</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td>Logiciels utilisés pour analyser les séquences de Sanger afin d’identifier les indels</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille laser P-2000</td><td>Sutter</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (MgSO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>Pour le tampon M9, également utilisé dans NGM</td></tr><tr><td>Embout du microchargeur 2x96ST</td><td>Calibre</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de montage du micromanipulateur pour Zeiss Axio Observer et Axiovert 200</td><td>Recherche Tritech</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Tritech</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>Nicotine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Tampon duplex sans nucléase</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq MasterMix</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de rangement pour pipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium, dibasique (K2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>KOH pour NGM</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium, monobasique (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Pour le tampon M9, également utilisé dans NGM</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles en quartz</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>S. hermaphroditium génome</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>Également utilisé dans les plaques de pyruvate M9, Dark LB, LB</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium, dibase (Na2HPO4.7H20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390</td><td>Pour le tampon M9</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>Également utilisé dans les plaques de pyruvate LB & nbsp ;</td></tr><tr><td>Pic à vis sans fin en fil de platine souple pour microinjection</td><td>Surepure Chemetals</td><td>6824</td><td>Platine 90 %, fil d’alliage à 10 % d’iridium, diamètre de 0,002 pouce x 5 pieds de long</td></tr><tr><td>Porte-aiguille standard</td><td>Recherche Tritech</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Steinernema hermaphroditum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Leica</td><td>Inveta 3</td><td></td></tr><tr><td>Tréhalose</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88195-99</td><td>0,08 M</td></tr><tr><td>Tris&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>Préadolescent 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de montage vertical pour micromanipulateur</td><td>Recherche Tritech</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mutagenèse basée sur crispr-cas9 dans le nématode entomopathogène steinernema hermaphroditum et le maintien des lignées mutantes

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

Mutagenèse basée sur CRISPR-Cas9 dans le nématode entomopathogène Steinernema hermaphroditum et le maintien des lignées mutantes

Entomopathogenic nematodes (EPNs) in the genus Steinernema and Heterorhabditis maintain mutualistic interactions with Xenorhabdus and Photorhabdus ...

Nous travaillons sur la génétique de la symbiose bactérienne nématode, qui a des applications agricoles. Les outils génétiques chez la bactérie Xenorhabdus sont très bien développés, mais la génétique de l’EPN reste limitée, reposant principalement sur des tests d’ARN et EMS. Pour commencer, obtenez des plaques d’agar au nématode semées de Xenorhabdus griffiniae et Comamonas aquaticus.Sélectionnez des nématodes Steinernema hermaphroditum sur les plaques NGM préparées contenant Xenorhabdus griffiniae. Couve-les à 25 à 28 degrés Celsius pour une croissance optimale. La veille de la microinjection, choisissez des hermaphrodites de stade J3 sur des plaques d’agar NGM fraîches semées de Xenorhabdus griffiniae.Le jour de la microinjection, choisissez de jeunes hermaphrodites adultes pour l’injection. Extraire la séquence du gène cible du génome de référence Steinernema hermaphroditum à l’aide de BlastP. Sélectionnez un exon codant précoce, de préférence le premier exon, et entrez la séquence dans CRISPRscan en utilisant les paramètres par défaut pour générer des ARN CRISPR candidats.Bombardez les principaux ARN candidats CRISPR contre le génome de Steinernema hermaphrodit pour éviter les correspondances hors cible. Stockez les ARN CRISPR sélectionnés et les ARN CRISPR trans-activants universels à 100 micromolaires chacun dans un tampon duplex à moins 80 degrés Celsius. Faites fondre du 2 % d’agarose dans de l’eau au micro-ondes.Transférez 50 microlitres d’agarose fondu sur un verre de recouvrement. Couvre-le immédiatement avec un second verre de couverture. Après un séchage de 20 minutes, retirez la vitre supérieure du couvercle, puis identifiez la face avant du tampon d’agarose.Conservez les tampons d’agarose à température ambiante pour une utilisation prolongée pendant des mois à des années. Pour préparer les aiguilles à l’injection, retirez des capillaires de quartz sur un extracteur de filament laser et stockez les aiguilles dans une boîte de stockage pour pipettes. Préparez de nouveaux duplex d’ARN-guide en mélangeant les crRNA sélectionnés et les ARN CRISPR trans-activants universels dans un rapport un pour un.Incubez le tube à 94 degrés Celsius pendant deux minutes, puis refroidissez à température ambiante pour recouvrir les duplex. Assemblez le mélange d’injection en combinant Cas9, chlorure de potassium et les duplex gRNA, puis incubez. Faites tourner le tube PCR trois fois pour mélanger, puis faites tourner brièvement pendant 10 à 15 secondes dans une mini-centrifugeuse.Après le dernier mélange, faites tourner jusqu’à une minute pour recueillir le contenu. Ensuite, utilisez une embout microchargeur pour charger un à deux microlitres de mélange d’injection dans l’aiguille. Montez l’aiguille sur le porte-aiguille, ouvrez la pointe en la faisant glisser sur du ruban adhésif double face sous de l’huile d’halocarbone.Et testez la taille de l’ouverture en utilisant la fonction « clean » du micro-injecteur. Placez une petite goutte d’huile d’halocarbone sur le tampon à 2 % d’agarose. À l’aide d’un microscope disséquant et d’un fil de platine souple, prenez un jeune hermaphrodite adulte.Lavez-le dans un tampon M9 pour éliminer les bactéries. Transférez le nématode sur un coussinet d’agarose, et placez-le dans une gouttelette d’huile d’halocarbone. Utilisez le fil de platine doux pour brosser doucement le nématode jusqu’à ce qu’il soit immobilisé.Montez la plaque sur l’étage de microinjection. Localiser un bras gonadal et le percer avec l’aiguille. Utilisez la fonction « clean » de l’injecteur pour délivrer le mélange d’injection à 99 livres par pouce carré jusqu’à ce que le flux gonadique soit visible, confirmant ainsi l’accès du réactif au syncytium.Si possible, repositionnez l’étage et injectez le second bras gonadal de la même manière. Immédiatement après l’injection, resuspendez l’animal injecté dans un à deux microlitres de tampon M9 sur le tampon d’agarose. Utilisez un fil de platine fin pour retirer le ver injecté sur la plaque, puis lavez l’huile avec un tampon M9, et réposez-le sur la plaque NGM de récupération ensemée de Comamonas aquatica.Incubez la plaque de récupération à 25 degrés Celsius toute la nuit. Le lendemain, isolez chaque nématode P0 injecté sur des plaques NGM individuelles semées de Xenorhabdus griffiniae. Deux ARN CRISPR ont été conçus pour cibler l’homologue Steinernema hermaphrodit de l’unc-22 sur des sites PAM précédemment publiés.L’analyse par bruit des nématodes exposés à la nicotine a montré des différences nettes de mouvement entre les mutants UNC-22 et les nématodes de type sauvage. Le génotypage des progénitus en contraction par PCR a révélé plusieurs bandes faibles au site cible pour Pam 3 et Pam 5. Le séquençage a confirmé les événements d’insertion et de suppression sur le site UNC-22 ciblé.Mon laboratoire a élargi mon travail postdoctoral en génétique des NPE. CRISPR est désormais disponible dans trois espèces de Steinernema. Dans ce protocole, nous avons mis en place une technique efficace pour créer des mutants stables et héréditaires en utilisant l’édition génique CRISPR-Cas9.Avec une édition génétique stable de CRISPR-Cas9, nous pouvons disséquer les mécanismes moléculaires derrière la symbiose Steinernema-Xenorhabdus.

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