Dosage de l’efflux de phospholipides spécifiques aux lipoprotéines de haute densité

Nous avons développé un test de substitution pour mesurer l’élimination des lipides de la plaque coronarienne médiée par le HDL afin d’évaluer le risque de maladie coronarienne. Le défi actuel est de développer un test d’influx lipidique HDL simple, rapide et robuste, pour des applications tant en recherche que cliniques. Pour commencer, ajoutez tout le contenu nécessaire dans un verre sous une hotte chimique, puis faites un vortex sur le mélange lipidique pour mélanger les solutions.

Séchez le mélange dans un tube en verre sous un jet doux d’azote pendant une heure pour former un film lipidique sec au fond du tube. Pour recouvert de silicate de calcium, insérez un cône de pesée dans le tube en verre contenant les lipides séchés et ajoutez 80 milligrammes de poudre d’hydrate de silicate de calcium dans le tube en utilisant le cône pour diriger la poudre vers la base. Ajoutez immédiatement 2 millilitres de solution saline normale dans le tube et couvrez le dessus avec du Parafilm.

Faites un vortex manuel sur le tube de verre pour déloger la majeure partie du lipide du fond. Placez le tube en verre dans un trou réalisé dans une plateforme en polystyrène reliée à un vortex et fixez le tube à la plateforme vortex à l’aide d’un ruban adhésif. Faites passer le tube en verre pendant 10 minutes et confirmez qu’il ne reste aucun lipide sur la paroi du tube.

Transférez le contenu du tube en verre dans un tube conique en plastique de 15 millilitres à l’aide d’une pipette de 1 millilitre. Lavez le tube en verre avec 3 millilitres de solution saline et transférez le lavage dans le même tube de 15 millilitres. Ensuite, placez le tube plastique de 15 millilitres contenant de l’hydrate de silicate de calcium recouvert de lipides dans une centrifugeuse et faites tourner à 935G pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius.

Utilisez une pointe longue et fine pour aspirer le surnageant. En partant du haut du surnageant, faites glisser lentement la pointe de la pipette le long du côté du tube tout en aspirant. Inclinez légèrement le tube lors de l’aspiration et laissez environ 200 microlitres de solution saline au-dessus du pellet pour éviter de le déranger.

Ensuite, ajoutez du sérum physiologique pour porter le volume total à 5 millilitres. Répétez la centrifugation et le retrait du surnageant quatre fois. Après le lavage final, ajoutez de la solution saline pour porter le volume total à 2,5 millilitres Pipette 75 microlitres de solution salée dans chaque puits d’une plaque de 0,3 millilitres à 96 puits selon le nombre de puits nécessaires pour l’ensemble d’échantillons.

Vortex, le tube plastique de 15 millilitres contenant LC-CSH, trois fois pendant 10 secondes chacun. À l’aide d’une pipette à puits unique, dispensez 50 microlitres de LC-CSH le long du côté droit des puits contenant du sérum salin. Après trois puits, répétez le protocole de vortex avant de distribuer dans les trois puits suivants.

Faites pivoter la plaque à 96 puits de 180 degrés de sorte que le côté gauche des puits soit maintenant à droite. Pipeter 25 microlitres de plasma ou d’échantillons sérumiques le long du côté droit de chaque puits. Pour les puits de contrôle positif, ajoutez 25 microlitres de plasma ou sérum lipidémique normal humain standard de référence.

Ensuite, scellez fermement la plaque à 96 puits avec un film adhésif et faites couver la plaque scellée dans l’obscurité pendant une heure à 37 degrés Celsius et 1 200 tours par minute dans un thermomélangeur. Après l’incubation, retirez la plaque du thermomixeur et placez-la sur de la glace. Centrifugez la plaque pendant deux minutes à 935G à 4 degrés Celsius pour pelleter les particules donneuses et arrêter la réaction de transfert.

Maintenant, retirez soigneusement le film adhésif de la plaque à 96 puits sans déranger la pastille LC-CSH. Transférez 50 microlitres de surnageant de la plaque de réaction dans les puits d’une plaque noire de polystyrène à fond plat à 96 puits à l’aide d’une pipette multi-puits. Remplissez un réservoir avec du sérum physiologique normal et ajoutez 50 microlitres de solution à chaque puits.

En utilisant une pipette multi-puits. Préparez 1 % du Triton X-100 dans une fiole Erlenmeyer en plastique de 125 millilitres. Remplissez un réservoir avec le Triton X-100 préparé à 1 %, et ajoutez 100 microlitres de la même solution à température ambiante dans chaque puits.

Mélangez doucement en faisant monter et descendre deux à trois fois avec une pipette multi-puits et faire éclater les bulles avec de l’air d’une pipette de transfert de 3 millilitres. Enfin, mesurez la fluorescence de la lissamine et rhodamine à l’aide d’un fluoromètre avec une excitation à 540 nanomètres et une émission à 600 nanomètres. Une courbe standard a été générée à l’aide de LC-CSH marqué LRHPE dilué en série et a montré une réponse de fluorescence très linéaire.

Dans l’étude de la courbe de concentration plasmatique, des volumes croissants de plasma humain regroupé ont été distribués dans des puits triples parallèlement aux témoins salins. La courbe de réponse à la dose plasmaque a montré une excellente linéarité entre l’EP, l’afflux et le volume plasmatique, avec une forte corrélation dans la fourchette de 15 à 35 microlitres. Notre protocole simple et rapide, qui prédit le risque de maladies cardiovasculaires incidentes, peut être utilisé aussi bien pour la recherche que pour les études diagnostiques cliniques.

Nos résultats démontrent que notre test peut éclaircir le rôle des lipides cellulaires et extracellulaires de la plaque dans les maladies cardiovasculaires.