Name: Imagerie calcique in vivo et ex-vivo d’un neurone du circuit olfactif chez la larve de Drosophila melanogaster du troisième stade (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique in vivo et ex vivo de neurones olfactifs chez les larves de Drosophila melanogaster. Cette méthode utilise un adhésif tissulaire pour immobiliser les échantillons et permet d'analyser les dynamiques calciques avec des scripts R personnalisés.

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1. Préparation des larves de drosophile du troisième stade pour l’imagerie calcique
<ol>
	<li>Maintenir les mouches avec de la nourriture standard (voir le tableau des matériaux) à 25 °C, avec une humidité relative (HR) de 50 à 60 % et un cycle lumière/obscurité de 12 h.</li>
	<li>Pour exprimer la protéine fluorescente rouge (RFP) pour l’identification des neurones et GCaMP6f (indicateur de calcium) dans le(s) neurone(s) d’intérêt ('X'), croisez des femelles vierges de la lignée X-Gal4 avec des mâles porteurs de UAS-GCaMP6f et UAS-tdTomato22. REMARQUE : Pour cette étude, la lignée Keystone-Gal4 a été utilisée pour stimuler l’expression de tdTomato et GCaMP6f dans une seule paire de neurones locaux inhibiteurs (Keystone-LNs) dans le cerveau larvaire18,19.</li>
	<li>Après avoir laissé les mouches mâles et femelles s’accoupler et pondre des œufs pendant 48 h, transférez les adultes dans un flacon frais.</li>
	<li>Extraire les larves du troisième stade (environ 120 h après la ponte) en les faisant flotter sur une solution de saccharose à 15 %. À l’aide d’une micropipette P1000, transférez les larves flottantes dans un bécher en verre de 1 000 ml.</li>
	<li>Lavez les larves 3 à 4 fois en remplaçant l’eau du bécher par 800 mL d’eau distillée fraîche à chaque fois. Laissez les larves se reposer pendant 10 minutes avant de procéder au reste du protocole.</li>
</ol>
2. Protocole de famine pour les larves de drosophile du troisième stade (si l’on teste des larves affamées par rapport à des conditions non affamées)
<ol>
	<li>Préparez deux chambres d’alimentation en plaçant un petit carré de lingette de laboratoire dans des boîtes de Pétri de 6 cm. Dans les cas où l’on ne souffre pas de famine, ajouter 350 μL de solution de saccharose 0,2 M ; en cas de famine, ajouter 350 μL d’eau distillée.</li>
	<li>Transférez un nombre égal de larves lavées dans chaque chambre d’alimentation. Laisser les larves se nourrir de saccharose (non affamé) ou d’eau distillée (affamée) pendant 2 h à température ambiante.</li>
</ol>
3. Imagerie calcique in vivo
REMARQUE : Toutes les expériences impliquant l’adhésif tissulaire doivent être menées selon les pratiques de sécurité standard du laboratoire. L’équipement de protection individuelle (EPI), y compris des gants en nitrile, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité ou un écran facial, est requis ; Les gants en coton doivent être évités en raison des réactions exothermiques avec le cyanoacrylate. Évitez tout contact de l’adhésif avec la peau, les yeux ou les muqueuses. En cas de collage cutané, trempez la zone dans de l’eau chaude savonneuse et séparez-la délicatement ; En cas d’exposition oculaire, rincer à l’eau tiède pendant ≥5 min et consulter immédiatement un médecin. L’adhésif doit être tenu à l’écart des flammes nues et des fortes chaleurs, car l’adhésif durci peut libérer des fumées irritantes s’il est brûlé. Conservez l’adhésif à ≤30 °C, à l’abri de l’humidité et de la lumière directe du soleil, dans un récipient hermétiquement fermé lorsqu’il n’est pas utilisé.
<ol>
	<li>Préparez le tampon d’imagerie calcique avec la composition suivante : NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucose 10 mM et HEPES 10 mM. Conserver à 4 °C lorsqu’il n’est pas utilisé. REMARQUE : La solution saline modifiée contenant 110 mM de NaCl est une formulation largement acceptée pour la dissection et l’imagerie du SNC larvaire et se situe dans la plage typique utilisée dans les études d’électrophysiologie et d’imagerie (≈108-128 mM de NaCl)23,24,25,26.</li>
	<li>Sur un microscope de 24 x 50 mm (1,5 mm d’épaisseur), créer un puits à l’aide de vaseline distribuée à partir d’une seringue.</li>
	<li>Placez une petite goutte d’adhésif tissulaire topique (60 % de cyanoacrylate de 2-octyle et 40 % de cyanoacrylate de n-butyle) au centre du verre de protection. Étalez uniformément l’adhésif en une couche mince et uniforme à l’aide d’une tige de verre.</li>
	<li>Transférez soigneusement une seule larve sur l’adhésif à l’aide d’une brosse ou d’un fil fin. Appuyez doucement sur la face ventrale de la larve sur l’adhésif. Laissez sécher l’adhésif, en vous assurant que la larve est complètement immobilisée.</li>
	<li>Une fois la larve immobilisée, placez le verre de protection sur la platine du microscope inversé (Figure 1A).</li>
</ol>
4. Imagerie calcique ex-vivo
<ol>
	<li>Préparez le tampon de dissection larvaire avec la composition suivante : NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucose 10 mM et HEPES 10 mM. Conserver à 4 °C lorsqu’il n’est pas utilisé.</li>
	<li>Disséquez les dissections cérébrales telles que décrites par Ishimoto et Sano10. Brièvement, à l’aide d’une brosse ou d’un fil fin, transférez une seule larve dans une boîte de Pétri de 3,5 cm avec un élastomère de silicone superposé au fond.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope de dissection, positionnez la larve avec sa face ventrale vers le haut et localisez le cerveau. À l’aide de ciseaux de dissection, faites une incision d’environ un tiers de l’extrémité antérieure de la larve. Faites une autre coupe au niveau des crochets de la bouche. Préservez le cerveau tout en retirant les crochets du corps et de la bouche (adapté de Janelia Flylight Protocol27).</li>
	<li>Identifiez l’amas de nerfs contenant des motoneurones de la moelle ventrale. À l’aide d’une pince, retirez doucement le cerveau du reste de la larve disséquée. Coupez tout excès de tissu du cerveau. REMARQUE : Manipulez doucement - une force excessive peut causer des dommages aux tissus car le cerveau est fragile.</li>
	<li>Préparez un verre de protection de microscope avec l’adhésif tissulaire pour l’imagerie calcique comme décrit aux étapes 3.2 à 3.3.</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette P10, aspirez soigneusement le cerveau disséqué avec 5 μL de solution de dissection de la boîte de Pétri. Expulsez lentement le cerveau sur l’adhésif. Avant que l’adhésif ne sèche, orientez le cerveau en position dorsale vers le haut (avec les deux lobes cérébraux vers le bas et le cordon ventral dorsal vers le haut).</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette P200, transférez 100 μL du tampon d’imagerie calcique sur le cerveau larvaire immobilisé sur le verre de protection.</li>
	<li>Placez la vitre de protection avec le cerveau sur le microscope inversé, relié à un module de scanner confocal à disque rotatif et à une caméra CCD pour l’imagerie calcique (Figure 1B). REMARQUE : Pour les préparations ex-vivo, assurez-vous d’orienter correctement le cerveau pendant que la colle est encore humide. Pour une qualité d’image optimale, positionnez le cerveau de manière à ce que le retour d’intérêt soit le plus proche de l’objectif du microscope et évitez d’appliquer un excès de colle près du point d’intérêt.</li>
</ol>
5. Protocole d’imagerie
<ol>
	<li>Ouvrez le logiciel d’imagerie calcique à l’aide du microscope confocal. Capturez des images à l’aide d’un objectif 10x/1,4 NA avec commutation de filtre entre le laser GFP (excitation 488 nm, intensité 70 %, émission 525 nm/50 m, OD8) et le laser RFP (excitation 561 nm, intensité 50 %, émission 610 nm/75 m, OD8). Réglez l’exposition entre 100 ms et 1 000 ms, le gain à 50 % de la valeur d’exposition correspondante et un facteur de binning de 2 lors de la capture d’image.</li>
	<li>Réglez le microscope sur un grossissement de 10x et localisez le cerveau sous un éclairage en fond clair.</li>
	<li>Identifiez le neurone d’intérêt en recherchant le signal tdTomato avec le laser RFP (excitation réglée à 561 nm). REMARQUE : Sélectionnez la saturation et réduisez le gamma pour régler la valeur d’exposition correcte.</li>
	<li>Une fois la région d’intérêt (ROI) identifiée, passez au laser GFP (excitation réglée sur 488 nm) pour capturer les signaux GCaMP6f. Assurez-vous que les signaux tdTomato et GCaMP colocalisent avant de capturer des images de pile des deux canaux. REMARQUE : Ajustez les paramètres d’image pour les enregistrements de pile tdTomato et GCaMP6f afin de maximiser la fluorescence.</li>
	<li>Capturez simultanément deux enregistrements de séries temporelles distinctes de signaux tdTomato et GCaMP6f à une vitesse de 0,5 image/s (pour un total de 2 min). REMARQUE : Le cerveau larvaire disséqué reste viable pendant environ 10 minutes dans ces conditions tampons ; Passé ce délai, les signaux se dégraderont.</li>
	<li>Une fois que l’échantillon est prêt à être image, capturez simultanément deux enregistrements de séries temporelles distinctes de signaux tdTomato et GCaMP6f à une vitesse de 0,5 image/s (pour un total de 2 min). REMARQUE : Le cerveau larvaire disséqué reste viable pendant environ 10 minutes dans ces conditions tampons ; Passé ce délai, les signaux se dégraderont. REMARQUE : Lors de l’analyse quantitative, nous vous recommandons d’augmenter la puissance du laser et d’ajuster le gain d’exposition du détecteur au besoin tout en maintenant une échelle d’intensité linéaire.</li>
</ol>
6. Traitement et analyse des données
<ol>
	<li>Ouvrez et importez les piles de signaux tdTomato et GCaMP6f dans ImageJ (NIH)28.</li>
	<li>Pour identifier la bonne région d’intérêt (ROI), fusionnez les signaux tdTomato et GCaMP6f pour confirmer la colocalisation. Après vérification, séparez les canaux tdTomato et GCaMP6f.</li>
	<li>Dans le menu supérieur, sélectionnez Plugins | Nouveau, puis cliquez sur Macros pour lancer une nouvelle macro. Ensuite, importez les macros personnalisées basées sur le retour sur investissement dans ImageJ. Sélectionnez la pile GCaMP6f et appuyez sur Exécuter pour l’analyse du calcium.</li>
	<li>Traitez les signaux de fluorescence à l’aide d’une macro ImageJ personnalisée (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). La macro génère d’abord des projections d’intensité maximale, effectue une correction de mouvement à l’aide du plug-in StackReg (mode d’enregistrement rigide)29 et applique une correction de blanchiment.</li>
	<li>Une fenêtre contextuelle « Action requise » s’affichera pour demander une sélection manuelle du retour sur investissement, ce qui permet aux utilisateurs de dessiner manuellement un retour sur investissement large. Cliquez sur OK pour poursuivre l’analyse. Pour effectuer une correction de mouvement, assurez-vous que la boîte rectangulaire couvre l’intégralité de la valeur d’intérêt dans toutes les images pour une correction de mouvement précise tout en conservant l’espace local et la forme de la zone d’intérêt sur toutes les images. REMARQUE : Les enregistrements ont été enregistrés dans ImageJ à l’aide de StackReg. Lorsque le mouvement dans le plan était important (déplacement XY cumulé &gt; 1 μM) ou que la dérive axiale en Z entraînait une perte de mise au point, le repérage devenait peu fiable ou l’échantillon était entièrement perdu de la fenêtre d’imagerie. Ainsi, les échantillons présentant une dérive extrême ou une baisse des signaux calciques (&gt;30 %) ont été automatiquement étiquetés et exclus de l’analyse en aval pour garantir des mesures précises de l’activité neuronale. Ces seuils sont conformes aux pratiques de contrôle de la qualité couramment appliquées dans les études d’imagerie calcique 30,31,32,33. L’exclusion a également permis de s’assurer que seuls des enregistrements stables avec des transitoires calciques fiables liés à des stimuli ont été utilisés pour les analyses.</li>
	<li>Pour l’analyse, extraire des traces de fluorescence à partir de ROI circulaires définis manuellement, guidés par l’autocorrélation des pixels ; ces zones d’intérêt engloberont l’ensemble du champ des neurones clés.<ol>
		<li>Extrayez les données brutes d’intensité de fluorescence pour deux fluorophores : GCaMP6f/GFP et tdTomato/RFP, à l’aide de macros personnalisées dans ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Appliquez une fenêtre coulissante avec un retour d’intérêt de 20 x 20 pixels et une taille de pas de 10 pixels dans le champ de vision. Pour chaque retour sur investissement, la macro calculera : (1) l’intensité sur toutes les images, (2) la différence de fluctuation de référence (c’est-à-dire la différence entre les valeurs d’intensité maximale et minimale pendant les 10 premières images) et (3) la variation d’intensité maximale d’une image à l’autre (ΔF). Les retours sur investissement présentant des fluctuations d’intensité inférieures à 10 unités seront éliminés, et seules les valeurs ΔF les plus nettes seront sélectionnées pour une analyse plus approfondie.</li>
		<li>Normalisez les traces de fluorescence à l’aide des méthodes suivantes :<ol>
			<li>Normalisation Fmax et Fmin : Calculez Δ normalisé à l’aide de la formule : 
			<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq1.jpg" style="margin: auto;"> Où F est la fluorescence brute à chaque point temporel, Fmin est la fluorescence minimale (ligne de base) et Fmax est la fluorescence maximale pendant l’enregistrement.</li>
			<li>Normalisation ΔF/F 0 : De plus, effectuez la normalisation ΔF/Fo, où Fo (ligne de base) est déterminé par les 10 premières images de chaque enregistrement, à l’aide de la formule : 
			<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68956/68956eq2.jpg" style="margin: auto;"> Où Ft est la fluorescence à l’instant t, et F0 est la valeur de base calculée à partir des 10 premières images.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Après avoir extrait les signaux GCaMP6f, cliquez avec le bouton gauche de la souris et sélectionnez tout, couper et coller pour transférer toutes les valeurs vers une nouvelle feuille de calcul Excel. Dans la barre de menu supérieure, sélectionnez Données | Texte en colonnes. Une fenêtre contextuelle de l’assistant « Texte en colonne » apparaîtra. À l’étape 1, sélectionnez Délimité, puis cliquez sur Suivant. À l’étape 2, sous Délimiteurs, sélectionnez Onglet et virgule, puis cliquez sur Suivant. À l’étape 3, sélectionnez Terminer. FACULTATIF : Pour tracer les signaux calciques normalisés, mettez Fnorm_FminFmax en surbrillance et sélectionnez Nuage de points.</li>
	<li>Recherchez un fichier .csv généré contenant : (1) les valeurs de fluorescence brutes F, (2) ΔF/Fo et (3) Fnorm (intensité de fluorescence normalisée). Organisez l’ensemble de données final en quatre colonnes : (1) temps (images), (2) état de l’échantillon (affamé ou alimenté), (3) ID de réplication (échantillon individuel) et (4) intensité normalisée (valeurs Fnorm échelonnées de 0 à 1).</li>
	<li>Enfin, effectuez l’analyse et la visualisation des données en R à l’aide de scripts R personnalisés (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. voir la Table des matériaux).<ol>
		<li>Importez le script R personnalisé dans un nouveau projet R. Assurez-vous que les packages R requis, y compris ggplot2, dplyr et readr, sont installés et mis à jour avant d’exécuter l’analyse.</li>
		<li>À partir de la ligne 1 du script R personnalisé, appuyez sur Exécuter en continu pour effectuer l’analyse du calcium. Assurez-vous également que la sortie comprend des cartes thermiques illustrant l’intensité calcique normalisée pour les 30 premières images, les 60 images et toutes les images de l’enregistrement de la série chronologique, ainsi que des boîtes à moustaches pour montrer la médiane des intensités normalisées.</li>
		<li>Évaluer la signification de l’intensité calcique normalisée à l’aide du test U de Mann-Whitney.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Élimination et décontamination des déchets
<ol>
	<li>Après les expériences, retirez les débris grossiers des outils et des surfaces sous l’eau courante, puis désinfectez avec de l’éthanol à 70 % ou de l’eau de Javel à 10 % suivi d’eau stérile. Travailler sur une surface désinfectée et se laver les mains après avoir retiré le gant ; Ne mangez pas et ne buvez pas en laboratoire.</li>
	<li>Placez les tissus larvaires et les produits jetables contaminés dans des sacs à risques biologiques et un autoclave avant de les éliminer.</li>
	<li>Jeter les déchets adhésifs entièrement durcis dans les ordures ménagères ; Les adhésifs non durcis et les produits jetables contaminés doivent être collectés dans un conteneur de déchets chimiques dangereux scellé et étiqueté.</li>
	<li>Placez tous les objets tranchants (lames, aiguilles, verre brisé) dans un contenant résistant aux perforations.</li>
	<li>Recueillir les solvants inflammables (éthanol, acétone) dans des contenants de déchets inflammables étiquetés.</li>
</ol>

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<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).</li>
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<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
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<li>Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+facilitation+by+neuropeptide+signaling+mediates+odor-driven+food+search%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search.</a> Cell. 145 (1), 133-144 (2011).</li>
<li>Slankster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+underlying+starvation-dependent+modulation+of+olfactory+behavior+in+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva.</a> Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).</li>
<li>Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+TRP+channels+in+auditory+transduction+and+amplification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila.</a> Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn%3A+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Simpson, J. H., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+and+optogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional imaging and optogenetics in Drosophila.</a> Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Actions de mouches & Entretien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nourriture pour mouches Nutrifly</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-112</td><td></td></tr><tr><td>UAS-GCaMP6f, tdTomato</td><td>Don du Dr JH Kim & nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)</td><td>BDSC</td><td>49232</td><td></td></tr><tr><td>Protocole de réactifs pour la famine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Petri de 6 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs pour tampon d’imagerie et de dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>J.T. Baker, Avantor Sciences</td><td>JT1311-1</td><td>CAS : 1311-01, 500g</td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16828.36</td><td>CAS : 50-99-7, 500g</td></tr><tr><td>HEPES-2-[4-(2-Hydroxyéthyle)-1-piperazinyl]-acide éthanosulfonique</td><td>J.T. Baker, Avantor Sciences</td><td>JT4018-1</td><td>CAS : 4018-01, 100g</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>VWR</td><td>97064-150</td><td>CAS : 7786-30-3, 100g</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J64189.36</td><td>CAS : 7447-40-7, 500g</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>EMD Milipore Sigma</td><td>EMD-SX0420-1</td><td>CAS : 7647-14-5, 500g</td></tr><tr><td>Outils et réactifs pour la dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de dissection</td><td></td><td></td><td>Composition fournie dans le texte</td></tr><tr><td>Plaques de Petri Olympus, 60 x 15 mm ventilées</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>Base en élastomère Sylgard 184</td><td>Sciences de la microscopie électronique</td><td>24236-10A</td><td></td></tr><tr><td>Agent de durcissement à base d’élastomère Sylgard 184</td><td>Sciences de la microscopie électronique</td><td>24236-10B</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler Style 5, EMS</td><td>Sciences de la microscopie électronique</td><td>78320-5</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas - Tranchant de 3 mm</td><td>Outils scientifiques finement</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Imagerie et montage des équipements/réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Module de scanner confocal</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-W1</td><td>Connecté au microscope</td></tr><tr><td>Tampon d’imagerie</td><td></td><td></td><td>Composition fournie dans le texte</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8&nbsp ;</td><td>Connecté à un module de scanner confocal à disque tournant et à une caméra CCD</td></tr><tr><td>Verre de couverture microscopique, 24 mm x 50 mm, épaisseur # 1,5</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif topique MWI Veterinary GLUTURE</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0632797</td><td></td></tr><tr><td>Vaselée pure</td><td>Walgreens</td><td>912556</td><td></td></tr><tr><td>Liens vers des ressources publiques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td></td><td></td><td>https://www.biorender.com/</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>912556</td><td>https://imagej.net/ij/</td></tr><tr><td>Vidéo du protocole Janelia Flylight</td><td>https://www.janelia.org/</td><td></td><td>https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o</td></tr><tr><td>Mathew Lab Github</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging</td></tr></tbody></table>

imagerie calcique in vivo et ex-vivo d’un neurone du circuit olfactif chez la larve de drosophila melanogaster du troisième stade

In-vivo and Ex-vivo Calcium Imaging of an Olfactory Circuit Neuron in the Third-Instar Drosophila melanogaster Larva

Pour démontrer notre approche d’imagerie calcique larvaire, nous l’avons appliquée avec succès à des préparations in vivo et ex-vivo de larves de drosophile (Figure 2 et Figure 3, Vidéo 1, Vidéo 2, Vidéo 3 et Vidéo 4). Nous avons mesuré la dynamique calcique chez des larves de drosophile exprimant GCaMP6f et Td-Tomato dans une seule paire de Keystone-LNs dans le cerveau larvai...

Imagerie calcique in vivo et ex-vivo d’un neurone du circuit olfactif chez la larve de Drosophila melanogaster du troisième stade

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Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

Cette vidéo décrit l’imagerie calcique in vivo dans les neurones de la drosophile à l’aide de GCaMP. Le clip du protocole présenté montre comment enregistrer les changements de fluorescence GCaMP des neurones du corps du champignon pendant une expérience de conditionnement olfactif.

Drosophile In Vivo L’imagerie calcique : une méthode d’imagerie fonctionnelle de l’activité neuronale

Cette vidéo présente une méthode d’imagerie calcique in vivo utilisant des capteurs de calcium localisés synaptiquement chez les mouches. Il décrit les étapes de préparation des mouches pour la microscopie, la réalisation d’un conditionnement olfactif et la visualisation de l’afflux de calcium induit par les odeurs.

in vivo Imagerie calcique à l’aide de capteurs calciques localisés synaptiquement chez Drosophila melanogaster

Source : Ishimoto, H. et al., imagerie calcique ex vivo pour visualiser les réponses cérébrales à la signalisation endocrinienne chez la drosophile. J. Vis. Exp. (2018) Cette vidéo démontre l’imagerie calcique à étudier Drosophila réponses cérébrales aux neuropeptides. Les neurones exprimant un indicateur de calcium fluorescent révèlent la dynamique du calcium intracellulaire et les réponses fonctionnelles aux molécules de signalisation.

Imagerie calcique ex vivo pour étudier les réponses cérébrales de la drosophile aux neuropeptides

Ici, nous illustrons comment microscopie photoactivation localisation seule molécule peut être effectuée sur le terminal de nerf moteur d’un live de Drosophila melanogaster troisième stade larve.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

Cet article décrit un protocole pour ex vivo imagerie calcique du cerveau drosophile . Dans cette méthode, des composés naturels ou synthétiques peuvent être appliqués à la mémoire tampon pour tester leur capacité à activer les neurones particulières dans le cerveau.

Ex Vivo Imagerie calcique pour visualiser le cerveau réponses à signalisation endocrinienne chez la drosophile

Ici nous présentons un protocole avec lequel le calcium pré- et/ou postsynaptic peut être visualisé dans le contexte de l'apprentissage et de la mémoire de Drosophila. L'imagerie in vivo de calcium utilisant des capteurs de calcium synaptically localisés est combinée avec un paradigme olfactif classique de telle sorte que la plasticité synaptique sous-jacente à ce type d'apprentissage associatif peut être déterminée.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster In Vivo

Ici, nous discutons d’un flux de travail pour préparer, disséquer, monter et imager des cerveaux d’explants vivants de larves du troisième stade de Drosophila melanogaster afin d’observer la dynamique cellulaire et subcellulaire dans des conditions physiologiques.

Imagerie de cellules vivantes du cerveau larvaire du troisième stade de Drosophila melanogaster

Nous présentons ici un protocole d’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 pour surveiller les activités épileptiformes. Le protocole fournit un outil précieux pour étudier les événements ictaux chez la drosophile adulte par imagerie calcique ex vivo , permettant d’explorer les mécanismes potentiels de l’épilepsie au niveau cellulaire.

Ex Vivo Imagerie calcique pour le modèle d’épilepsie de la drosophile

Une approche d’imagerie calcique permet d’enregistrer les réponses induites par le goût dans le cerveau des mouches éveillées pendant qu’une solution est appliquée sur le labelle. Les réponses gustatives primaires chez Drosophila melanogaster sont utilisées à titre d’exemple, mais ce protocole peut être adapté pour étudier les neurones en aval ou d’autres espèces.

In vivo Imagerie calcique des réponses neuronales induites par le goût chez la drosophile adulte

Découvrez l'imagerie calcique in vivo et ex vivo de neurones olfactifs chez les larves de Drosophila melanogaster. Cette méthode utilise un adhésif tissulaire pour immobiliser les échantillons et permet d'analyser les dynamiques calciques avec des scripts R personnalisés.

Imagerie calcique in vivo et ex-vivo d’un neurone du circuit olfactif chez la larve de Drosophila melanogaster du troisième stade (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie calcique in vivo et ex-vivo d’un neurone du circuit olfactif chez la larve de Drosophila melanogaster du troisième stade

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