Préparation d’échantillons pour les études métabolomiques par spectrométrie de masse sur cellule unique : lavage, trempe, séchage et stockage combinés des cellules

Nous avons développé des protocoles pour préserver l’intégrité des métabolites cellulaires pour les études de spectrométrie de masse sur cellule unique. Nous avons étudié comment les conditions de lavage, de trempe et de stockage affectent les métabolites cellulaires. De nouvelles méthodes de préparation d’échantillons et de spectrométrie de masse ont récemment été mises au point pour faire progresser les études métabolomiques sur cellule unique afin de mieux comprendre l’hétérogénéité cellulaire et les mécanismes des maladies.

Les chercheurs doivent surmonter de multiples défis clés, notamment une quantité limitée d’échantillons, une sensibilité de détection réduite en raison de la complexité de l’échantillon et des métabolites altérés en raison de la préparation et de l’analyse des échantillons. Nous démontrons des techniques complètes de préparation d’échantillons qui peuvent préserver les métabolites cellulaires et l’intégrité cellulaire pour les études métabolomiques par spectrométrie de masse sur cellule unique. Nos protocoles pourraient offrir un moyen simple et efficace de préparation, de stockage et de transport d’échantillons pour des études métabolomiques sur cellule unique à l’aide de différentes techniques de spectrométrie de masse.

Pour commencer, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone. Surveillez quotidiennement la confluence des cellules et faites-les passer lorsque les cultures atteignent 80 % de confluence. Pour le passage, aspirez le milieu du plat et rincez une fois avec cinq millilitres de PBS.

Incuber les cellules avec deux millilitres de 0,25 % de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes pour faciliter le détachement des cellules. Neutralisez la trypsine en ajoutant huit millilitres de milieu complet préchauffé et pipetez doucement pour disperser les cellules. Transférez un millilitre de suspension dans neuf millilitres de milieu frais et complet pour compter les cellules.

Pour ensemencer les cellules, diluez-les à une concentration finale de un fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Placez des lamelles individuelles en verre de 18 millimètres dans les puits d’une plaque à 12 puits. Ajoutez deux millilitres de milieu complet et 200 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits pour obtenir deux fois 10 à la puissance cinq cellules par puits.

Incuber les cellules pendant la nuit pour permettre l’attachement. Pour laver les cellules, ajoutez deux millilitres de solution froide de formiate d’ammonium dans chaque puits de la plaque à 12 puits. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, soulevez doucement chaque lamelle contenant des cellules d’adhérence de son puits et placez-la brièvement pendant deux à trois secondes dans un puits séparé prérempli de deux millilitres de solution froide de formiate d’ammonium à 0,9 %.

Placez chaque lamelle rincée au formiate d’ammonium, les cellules vers le haut, dans une boîte de Pétri à l’intérieur d’un récipient en papier d’aluminium. Versez lentement 10 à 20 millilitres d’azote liquide sur les lamelles pour assurer une couverture complète. Et inclinez immédiatement la boîte de Pétri avec une pince à épiler pour décanter l’azote liquide restant.

À l’aide de gants cryogéniques et d’une pince à épiler isolée, placez la boîte de Pétri contenant les glissières du couvercle de refroidissement à l’azote liquide dans la chambre du concentrateur sous vide. Traitez les échantillons à l’aide des réglages de vide standard pendant cinq à sept minutes jusqu’à ce que l’azote liquide visible s’évapore et que les lamelles semblent sèches. Assurez-vous que les lamelles séchées ne contiennent pas de résidus d’azote liquide ou de cristaux de glace.

Ensuite, enveloppez le récipient avec une serviette en papier et transférez-le dans un congélateur à 80 degrés Celsius pendant 48 heures. Après l’entreposage, transférez les lamelles contenant la boîte de Pétri dans un appareil desséché à température ambiante pendant 10 minutes. Assurez-vous que le givre condensé ou l’eau sur les lamelles disparaît complètement avant de les retirer du dessiccateur.

Divisez les échantillons en deux groupes et traitez-les de manière appropriée. Montez maintenant la sonde unique sur la platine XYZ et fixez-la à un manipulateur XYZ motorisé placé sous un microscope numérique. Couplez la configuration à sonde unique à un spectromètre de masse pour l’analyse SCMS.

Utilisez de l’acétone nitrile contenant 0,1 % d’acide formique d’une pureté d’au moins 99,9 % comme solvant d’extraction et administrez-le à un débit de 150 nanolitres par minute à l’aide d’un pousse-seringue. Définissez les paramètres de spectrométrie de masse pour les modes d’ions positifs et négatifs. Maintenant, placez les deux lamelles du premier groupe et du groupe deux sur la platine XYZ motorisée de la configuration SCMS à sonde unique et utilisez le microscope pour sélectionner au hasard les cellules à analyser.

Après avoir acquis les spectres de masse, analysez environ 30 cellules par groupe à l’aide de la même sonde, du même débit de solvant et de la même tension d’ionisation. Prétraitez les données SCMS brutes à l’aide d’un script R personnalisé et appliquez la suppression de l’arrière-plan et du bruit, suivie de la normalisation de l’intensité ionique au courant ionique total. Déisotope des données SCMS à l’aide du package Python MSD isotope.

Effectuez l’alignement des pics à l’aide d’un script Python interne. Appliquez une largeur de bac de 0,01 rapport de charge principal pour le regroupement et une tolérance de masse de 0,01 rapport de charge principal ou cinq parties par million pour l’alignement des crêtes. Effectuez des analyses statistiques de données à l’aide de Metabo Analyst 6.0.

Effectuez un test T et générez une carte thermique montrant les niveaux relatifs de métabolites. Sélectionnez l’option utilisée les 100 premiers et le test T ou Inova pour générer les 100 principaux métabolites classés par signification et tracez une carte thermique à l’aide de ces 100 principaux métabolites avec des différences significatives. Enfin, recherchez les valeurs de charge principale précises dans la base de données du métabolome humain en utilisant une tolérance de masse de 10 parties par million pour la recherche dans la base de données.

L’analyse des composantes principales en mode d’ions positifs a montré que le premier et le deuxième groupe se chevauchaient étroitement, indiquant des profils de métabolites très similaires. Dans le mode d’ions négatifs, un modèle comparable a été observé, bien que le deuxième groupe soit apparu légèrement plus distinct. L’analyse de la carte thermique des 100 principaux métabolites a montré des modèles d’abondance très cohérents entre le groupe un et le groupe deux dans les deux modes ioniques.

Aucun changement majeur ou regroupement spécifique à un groupe n’est observé. Bien que des variations mineures dans quelques groupes de métabolites puissent refléter des différences dans l’efficacité de l’ionisation ou la stabilité des métabolites.