Induction de précision et distinction des réflexes de toux et d’éternuement chez la souris

Ce protocole se concentre sur le réflexe respiratoire chez la souris. Nous visons à stimuler la trachée et la cavité nasale pour provoquer la toux et les éternuements, et cela fera la différence entre ces deux types d’événements en fonction des caractéristiques audio. Des études antérieures utilisaient souvent de la capsaïcine nébuleuse ou de l’acide citrique pour stimuler le contrôle respiratoire ainsi que les comportements de toux et d’éternuement chez la souris.

Cependant, il reste incertain si la stimulation du contrôle respiratoire par nébulisation induit la toux, les éternuements ou les deux, car il n’existe actuellement aucune méthode fiable pour distinguer ces deux réponses. Pour ce projet, nous avons mis en place une méthode pour induire la toux et les éternuements en stimulant sélectivement la trachée ou la cavité nasale. Nous avons également utilisé une analyse acoustique pour identifier les caractéristiques distinctives entre la toux et l’éternuement.

Nos recherches massives fournissent un outil puissant qui soutiendra directement le développement de futurs médicaments contre les troubles de la toux et des éternuements. Pour commencer, découpez une aiguille de calibre 28 en une canule d’environ cinq millimètres de long. À l’aide de pinces et de papier abrasif, lissez les deux extrémités et fixez une extrémité sur un tube en silicone.

Connectez la canule reliée à un tube à une seringue d’un millilitre, puis rincez la canule à l’eau pour vérifier la persévérance. Ensuite, pliez la canule à un angle de 90 degrés avec un rapport de deux à trois bras. Insérez le bras le plus long dans le tube en silicone de cinq centimètres de long.

Attribuez aléatoirement les souris à trois groupes, chacun avec six souris. Maintenant, fixez la souris anesthésiée en position couchée sur la table. Après avoir rasé les poils crâniens et cervicaux, désinfectez la zone avec de l’iodophore et de l’alcool.

Au microscope, incisez la peau cervicale d’environ un centimètre, puis disséquez de façon obtonne les tissus et les muscles pour exposer la trachée. Perforez les tissus mous entre les cartilages cricoïd et trachéal à l’aide d’une aiguille de calibre 32. Ensuite, créez une ouverture trachéale minimale avec des ciseaux ophtalmiques.

Insérez la canule métallique gainée de silicone à environ un millimètre dans la lumière trachéale, et sécurisez la jonction canule-trachée avec une suture 7-0. Maintenant, incisez le cuir chevelu d’environ un centimètre, puis creusez un tunnel sous-cutané de façon déplacée du cou jusqu’au crâne. Faites passer le tube en silicone par le tunnel sous-cutané jusqu’au crâne, fixez-le sur le crâne avec du ciment dentaire, puis recoudez la peau.

Suture l’incision cervicale et laisse l’animal récupérer pendant cinq jours. Ajustez la sonde ultrasonore avec un anneau d’étanchéité compatible avec le port et insérez la sonde dans le port de la chambre de pléthysmographie de tout le corps pour assurer un contact hermétique. Connectez la chambre de pléthysmographie à corps entier au capteur de flux et au système de polarisation.

Fixez un tube en silicone fixé au crâne à un tube d’extension de 30 centimètres, et placez la souris dans la chambre de pléthysmographie de tout le corps. Prolongez le tube par le port supérieur de la chambre et scellez le port à l’aide d’argile à modeler autour du tube. Vérifiez l’étanche à l’air en confirmant que les pics de la forme d’onde respiratoire se situent dans une catégorie de quatre, plus ou moins deux.

Connectez une seringue d’un millilitre chargée de cinq millilitres de solution de capsaïcine au tube d’extension, et montez-la sur la pompe à microinjection. Placez une caméra à grande vitesse orientée vers la chambre. Ajustez la distance et la mise au point de la caméra pour une vue claire, et réglez la fréquence d’échantillonnage à 160 images par seconde.

Maintenant, lancez simultanément la pléthysmographie du corps entier, l’échographie et le logiciel de la caméra. Déclenchez la pompe pour commencer l’infusion de capsaïcine, et notez les taux de toux pendant 10 minutes. Préparez les animaux et tous les matériaux nécessaires à la procédure.

Après avoir anesthésé et préparé la souris, fixez-la dans un cadre stéréotaxique. Désinfectez la zone chirurgicale avec de l’iodophore et de l’alcool. Incisez la peau au-dessus du crâne et de l’os nasal, en utilisant un scalpel pour exposer l’os nasal.

À l’aide d’une microperceuse, créez un trou de 0,5 millimètre à la jonction entre l’os nasal et le processus latéral du cartilage nasal. Maintenant, exposez la muqueuse nasale par le trou de meule. Soulevez doucement la muqueuse nasale à l’aide d’une aiguille calibre 32 pour exposer la cavité nasale.

Ensuite, montez le tube en polyéthylène dans le bras stéréotaxique. Alignez la pointe du tube à fleur de l’ouverture du trou de meule, fixez le tube sur l’os nasal avec du ciment dentaire, puis recoudez la peau. Placez la souris sur un coussin chauffant et laissez-la récupérer jusqu’à ce que vous reprenez conscience.

Connectez la chambre de pléthysmographie à corps entier au capteur de flux et au système de polarisation selon le manuel du fabricant. Ensuite, installez la sonde ultrasonique avec un joint adapté au port. Insérez la sonde dans la chambre de pléthysmographie et vérifiez un joint hermétique.

Transférez la souris dans la chambre de pléthysmographie et prolongez le tube en polyéthylène par le port supérieur. Scellez le port avec de la pâte à modeler pour fixer le tube. Vérifiez l’étanche à l’air de la chambre et installez la caméra comme démontré précédemment.

Enfin, avancez un filament de nylon de 0,25 millimètre de diamètre à travers un tube souple jusqu’à la cavité nasale à une profondeur de zéro à trois millimètres. Gardez cinq centimètres du filament exposés au-delà du tube portable. Lors de chaque stimulation, appuyez sur l’extrémité libre du filament jusqu’à ce qu’il se plie à environ 45 degrés, délivrant environ 0,6 gramme de force sur la muqueuse nasale pendant une seconde.

Répétez la stimulation toutes les 30 secondes tout en enregistrant les réponses d’éternuement pendant 10 minutes. Les souris soumises à une chirurgie trachéale ou nasale avec stimulation nasale mécanique et défi trachéal capsaïcine ont significativement augmenté les événements d’éternuement et de toux, respectivement. Les enregistrements de pléthysmographie corporelle ont montré des traces respiratoires à un ou deux pics pour la toux induite par la capsaïcine et les éternuements mécaniques.

Les oscillogrammes sonores ont révélé que l’audio de la toux avait une intensité maximale soudaine au départ, concentrée dans la plage de zéro à 30 kilohertz. Alors que l’audio sneeze augmentait progressivement en intensité, couvrait une plage de zéro à 80 kilohertz et avait une durée plus longue. La phase de compression des toux à un seul pic était d’environ 32,39 millisecondes, significativement plus courte que les toux à double pic, autour de 53,17 millisecondes.

La phase moyenne de compression des éternuements à pic unique était d’environ 44,03 millisecondes, tandis que les éternuements à double pic étaient d’environ 74,24 millisecondes et étaient nettement plus longs. Les schémas de pic unique sont apparus dans 77,55 % des toux, tandis que seulement 32,42 % des éternuements ont montré des pics simples, avec des schémas de double pic dominant à 67,58 %. Les durées audio des éternuements étaient significativement plus longues que celles des toux, bien que des plages se chevauchent. La transsection des afférentes sensorielles nasales a significativement réduit les éternuements induits par la capsaïcine, tandis que la toux est restée intacte.