Name: Co-actine sédimentation Assay; pour lanalyse des Binding Protein à F-actine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Apprenez l'essai de co-sédimentation d'actine pour analyser les protéines liant l'actine filamentaire (F-actine). Cette méthode in vitro permet d'étudier les interactions protéine-actine dans la biologie cellulaire.

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Merci au Dr Praveen Kumar dans le laboratoire de Wittman à l&#39;UCSF pour le film de l&#39;actine dans des cellules HaCaT.

1. Préparation de l&#39;actine La source de l&#39;actine utilisé dans cet essai était non-musculaires plaquettes humaines (β-actine) obtenu à partir de aliquotes Cytosquelette Stock Inc à 10 mg / ml sont conservés dans le congélateur -70 ° C. Pour le dosage, l&#39;actine est dilué à 0,4 mg / ml dans un tampon contenant 5 mM de Tris pH 8, 0,2 mM de CaCl2, 0,2 mM d&#39;ATP et 0,5 mM de DTT, centrifugé à 20000 g pendant 10 min à 4 º C. Le surnageant, qui est l&#39;actine monomérique est prêt à être polymérisée. Polymérisation de l&#39;actine est induite par le KCl 50 mM outre, ATP 1 mM et 2 mM de MgCl2. La polymérisation se produit à température ambiante pendant 1 heure. 2. Préparation de protéines Dans ce test, nous utilisons le C-terminale de Talin, qui a été purifié comme une protéine GST-étiquetés. La protéine à être utilisé dans le dosage est soumis à une centrifugation à grande vitesse à pré-clair de granulats avant l&#39;incubation avec la F-actine. La protéine est filée à 100 000 g dans une ultracentrifugeuse Beekman pendant 20 minutes à 22 º C. 3. Actine-protéines d&#39;incubation Le montant de l&#39;actine et de protéines dans un test varie. Dans cet exemple nous utilisons l&#39;actine en excès. Normalement, un rapport molaire est calculé, par exemple. un rapport de 4:1 molaire de l&#39;actine à la protéine. Dans le test suivant, le volume final de réaction est de 150 pi. La mémoire tampon dans laquelle la protéine et la F-actine sont incubés dépendra de la protéine à tester et sur les conditions requises. Dans cet exemple, nous utilisons un tampon contenant 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM de DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM de CaCl2 et MgCl2 2 mM. La protéine et la F-actine sont incubés dans le tampon pendant 1 heure à température ambiante. 4. La sédimentation de F-actine Après l&#39;incubation, les échantillons sont centrifugés à 100 000 g à 22 º C. Nous utilisons une ultracentrifugeuse Beckman dans la vidéo. Le rotor est soigneusement enlevé afin de ne pas déranger les boulettes. 5. L&#39;analyse des protéines co-sédimentation avec F-actine Les surnageants sont soigneusement éliminé par pipettage dans un tube Eppendorf et 5 X tampon Laemmli SDS-PAGE de l&#39;échantillon est ajouté. Un volume approprié de tampon Laemmli 1 X échantillon SDS-PAGE est ajouté aux pastilles restantes, pipette de haut en bas, et transférés à de nouveaux tubes Eppendorf. Les quantités relatives de protéines dans les pastilles et les surnageants sont analysés suivant leur séparation par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie du gel ou Western Blot. Afin de déterminer la spécificité de l&#39;interaction des protéines avec l&#39;actine, l&#39;actine dépendante de la concentration de co-sédimentations peut être effectuée. Pour ce genre d&#39;expérience, d&#39;un montant fixe de la protéine et une série de quantités croissantes de l&#39;actine sont incubés, et l&#39;analyse est effectuée comme décrit ci-dessus.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

L&#39;actine co-sédimentation est un simple test in vitro pour analyser les protéines se liant à specfic F-actine. Dans cette vidéo, nous démontrons un exemple de comment une simple co-actine de sédimentation peut être effectuée. Nous montrons comment préparer la F-actine, préparer la protéine à tester et à la procédure de l&#39;actine de co-sédimentation. Un certain nombre de points doivent être considérés lors de la réalisation d&#39;actine co-sédimentation des dosages. Par exemple, les composants du tampon pour l&#39;incubation peut vari...

co-actine sédimentation assay; pour l&#39;analyse des binding protein à f-actine

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Le cytosquelette d&#39;actine dans la cellule est un réseau de filaments d&#39;actine qui permet le mouvement des cellules et des processus cellulaires, et qui génère des tensions et aide à maintenir la forme cellulaire. Bien que le cytosquelette d&#39;actine est une structure rigide, il est une structure dynamique qui est constamment remodelage. Un certain nombre de protéines peuvent se lier au cytosquelette d&#39;actine. La liaison d&#39;une protéine particulière à la F-actine est souvent souhaité pour soutenir la cellule observations biologiques ou pour mieux comprendre les processus dynamiques dues au remodelage du cytosquelette d&#39;actine. L&#39;actine co-sédimentation dosage est un dosage in vitro couramment utilisées pour analyser la liaison de protéines spécifiques ou de domaines protéiques avec F-actine. Les principes de base de l&#39;analyse implique une incubation de la protéine d&#39;intérêt (pleine longueur ou le domaine d&#39;) avec F-actine, étape d&#39;ultracentrifugation à granulés de F-actine et l&#39;analyse de la protéine co-sédimente avec F-actine. L&#39;actine co-sédimentation dosages peuvent être conçus en conséquence de mesurer les affinités de liaison et des dosages d&#39;actine concurrence.

Les protéines se lient à l&#39;actine filamenteuse (F-actine) grâce à des modules distincts actine contraignant. Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure de co-sédimentation actine, qui est un test in vitro couramment utilisées pour analyser les protéines ou des domaines spécifiques qui se lient F-actine.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

Le cytosquelette d'actine au sein de la cellule est un réseau de filaments d'actine qui permet le mouvement des cellules et les processus cellulaires, et qui génère ...

Dans la cellule. Le cytosquelette d'actine est une structure dynamique, et son remaniement joue un rôle important dans divers processus tels que la division cellulaire, la migration cellulaire et le transport physique. Un grand nombre de protéines peuvent se lier au cytosquelette d'actine grâce à des modules spécifiques de liaison à l'actine.Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure de co-sédimentation à l’actine, un test in vitro couramment utilisé pour analyser les protéines ou des domaines spécifiques de protéines capables de se lier à l’actine filamenteuse. Bonjour, je suis Jody Var du laboratoire de la Dre Diane Barber, du Département de biologie cellulaire et tissulaire de l’UCSF. Dans cette vidéo, je vais vous montrer comment réaliser un test de co-sédimentation à l’actine.Cette procédure constitue une méthode pour analyser les protéines qui se lient spécifiquement à l'actine filamenteuse et peut être utilisée pour mesurer les affinités de liaison. Cette procédure comprend les étapes suivantes : la formation de filaments d'actine et la préparation de la protéine à tester, l'incubation de la protéine d'intérêt avec l'actine filamenteuse (ou actine F pour faire court), la

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On applique l'étiquette sans analyse de l'interaction des protéines avec X100 Biacore structure-fonction de l'analyse de la liaison de plusieurs mutants cystatine B à travers la papaïne caractérisation cinétique. Étalonnage sans analyse de concentration (ACCP) mesure la concentration de protéine avec une activité de liaison maintenu sans la nécessité d'une courbe d'étalonnage. Nous montrons que la confirmation de concentrations en utilisant CFCA augmente la fiabilité de l'analyse cinétique et...

L&#39;importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d&#39;affinité en analyse structure-fonction

La polymérisation de FtsZ est essentielle pour la division cellulaire bactérienne. Dans ce rapport, nous détaillons des protocoles simples pour surveiller l’activité de polymérisation de FtsZ et discutons de l’influence de la composition du tampon. Les protocoles peuvent être utilisés pour étudier l’interaction de FtsZ avec des protéines régulatrices ou des médicaments antibactériens qui affectent la polymérisation de FtsZ.

Tests de polymérisation FtsZ : protocoles et considérations simples

Ce protocole décrit une méthode pour tester la capacité d'une protéine à co-sédimenter avec de l'actine filamenteuse (F-actine) et, si la liaison est observée, mesurer l'affinité de l'interaction.

Mesure de la liaison des protéines à la F-actine par co-sédimentation

Début endosome fonctions dépendent de la polymérisation de l’actine-F. Nous décrivons ici une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomale précoce dans des éprouvettes, rendant ainsi cette série complexe de réactions se prêtent à biochimiques et génétiques manipulations.

In Vitro Polymérisation de l’actine F sur Endosomes précoces

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

Pour avancer, les cônes de croissance doivent exercer des forces de traction contre l’environnement extérieur. La génération de forces de traction dépend de la dynamique de l’actine et de l’accouplement de l’embrayage. La présente étude décrit des méthodes d’analyse de la dynamique de l’actine, du couplage d’embrayage et des forces de traction pour l’avancement du cône de croissance.

Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

Nous présentons des protocoles pour des tests microfluidiques de filaments d’actine simples, en combinaison avec la microscopie à fluorescence, qui permettent de surveiller avec précision les filaments d’actine individuels en temps réel tout en les exposant séquentiellement à différentes solutions protéiques.

Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique

Ce protocole décrit la formation de bicouches lipidiques soutenues et l’ajout de filaments cytosquelettiques et de protéines motrices pour étudier la dynamique de réseaux cytosquelettiques reconstitués et attachés à la membrane à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Reconstitution de cortex minimembranaires d’actine sur des bicouches lipidiques soutenues

Ce protocole décrit comment produire des comètes d’actine à la surface des billes en utilisant des ingrédients protéiques disponibles dans le commerce. De tels systèmes imitent les structures protrusives trouvées dans les cellules et peuvent être utilisés pour examiner les mécanismes physiologiques de production de force de manière simplifiée.

Reconstitution de la motilité à base d’actine avec des protéines disponibles dans le commerce

Cette méthode décrit un essai de sédimentation in vitro à base de lectine pour quantifier l’affinité de liaison de la phosphatase glucane et de l’amylopectine. Ce test de co-sédimentation est fiable pour mesurer la liaison du substrat de la phosphatase glucane et peut être appliqué à divers substrats de glucane solubilisés.

Essai de sédimentation basé sur la concanavaline A pour mesurer la liaison au substrat des phosphatases glucanes

Apprenez l'essai de co-sédimentation d'actine pour analyser les protéines liant l'actine filamentaire (F-actine). Cette méthode in vitro permet d'étudier les interactions protéine-actine dans la biologie cellulaire.

Co-actine sédimentation Assay; pour l'analyse des Binding Protein à F-actine

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