Name: Co-actine sédimentation Assay; pour lanalyse des Binding Protein à F-actine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Apprenez l'essai de co-sédimentation d'actine pour analyser les protéines liant l'actine filamentaire (F-actine). Cette méthode in vitro permet d'étudier les interactions protéine-actine dans la biologie cellulaire.

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Merci au Dr Praveen Kumar dans le laboratoire de Wittman à l&#39;UCSF pour le film de l&#39;actine dans des cellules HaCaT.

1. Préparation de l&#39;actine La source de l&#39;actine utilisé dans cet essai était non-musculaires plaquettes humaines (β-actine) obtenu à partir de aliquotes Cytosquelette Stock Inc à 10 mg / ml sont conservés dans le congélateur -70 ° C. Pour le dosage, l&#39;actine est dilué à 0,4 mg / ml dans un tampon contenant 5 mM de Tris pH 8, 0,2 mM de CaCl2, 0,2 mM d&#39;ATP et 0,5 mM de DTT, centrifugé à 20000 g pendant 10 min à 4 º C. Le surnageant, qui est l&#39;actine monomérique est prêt à être polymérisée. Polymérisation de l&#39;actine est induite par le KCl 50 mM outre, ATP 1 mM et 2 mM de MgCl2. La polymérisation se produit à température ambiante pendant 1 heure. 2. Préparation de protéines Dans ce test, nous utilisons le C-terminale de Talin, qui a été purifié comme une protéine GST-étiquetés. La protéine à être utilisé dans le dosage est soumis à une centrifugation à grande vitesse à pré-clair de granulats avant l&#39;incubation avec la F-actine. La protéine est filée à 100 000 g dans une ultracentrifugeuse Beekman pendant 20 minutes à 22 º C. 3. Actine-protéines d&#39;incubation Le montant de l&#39;actine et de protéines dans un test varie. Dans cet exemple nous utilisons l&#39;actine en excès. Normalement, un rapport molaire est calculé, par exemple. un rapport de 4:1 molaire de l&#39;actine à la protéine. Dans le test suivant, le volume final de réaction est de 150 pi. La mémoire tampon dans laquelle la protéine et la F-actine sont incubés dépendra de la protéine à tester et sur les conditions requises. Dans cet exemple, nous utilisons un tampon contenant 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM de DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM de CaCl2 et MgCl2 2 mM. La protéine et la F-actine sont incubés dans le tampon pendant 1 heure à température ambiante. 4. La sédimentation de F-actine Après l&#39;incubation, les échantillons sont centrifugés à 100 000 g à 22 º C. Nous utilisons une ultracentrifugeuse Beckman dans la vidéo. Le rotor est soigneusement enlevé afin de ne pas déranger les boulettes. 5. L&#39;analyse des protéines co-sédimentation avec F-actine Les surnageants sont soigneusement éliminé par pipettage dans un tube Eppendorf et 5 X tampon Laemmli SDS-PAGE de l&#39;échantillon est ajouté. Un volume approprié de tampon Laemmli 1 X échantillon SDS-PAGE est ajouté aux pastilles restantes, pipette de haut en bas, et transférés à de nouveaux tubes Eppendorf. Les quantités relatives de protéines dans les pastilles et les surnageants sont analysés suivant leur séparation par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie du gel ou Western Blot. Afin de déterminer la spécificité de l&#39;interaction des protéines avec l&#39;actine, l&#39;actine dépendante de la concentration de co-sédimentations peut être effectuée. Pour ce genre d&#39;expérience, d&#39;un montant fixe de la protéine et une série de quantités croissantes de l&#39;actine sont incubés, et l&#39;analyse est effectuée comme décrit ci-dessus.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

L&#39;actine co-sédimentation est un simple test in vitro pour analyser les protéines se liant à specfic F-actine. Dans cette vidéo, nous démontrons un exemple de comment une simple co-actine de sédimentation peut être effectuée. Nous montrons comment préparer la F-actine, préparer la protéine à tester et à la procédure de l&#39;actine de co-sédimentation. Un certain nombre de points doivent être considérés lors de la réalisation d&#39;actine co-sédimentation des dosages. Par exemple, les composants du tampon pour l&#39;incubation peut vari...

co-actine sédimentation assay; pour l&#39;analyse des binding protein à f-actine

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Le cytosquelette d&#39;actine dans la cellule est un réseau de filaments d&#39;actine qui permet le mouvement des cellules et des processus cellulaires, et qui génère des tensions et aide à maintenir la forme cellulaire. Bien que le cytosquelette d&#39;actine est une structure rigide, il est une structure dynamique qui est constamment remodelage. Un certain nombre de protéines peuvent se lier au cytosquelette d&#39;actine. La liaison d&#39;une protéine particulière à la F-actine est souvent souhaité pour soutenir la cellule observations biologiques ou pour mieux comprendre les processus dynamiques dues au remodelage du cytosquelette d&#39;actine. L&#39;actine co-sédimentation dosage est un dosage in vitro couramment utilisées pour analyser la liaison de protéines spécifiques ou de domaines protéiques avec F-actine. Les principes de base de l&#39;analyse implique une incubation de la protéine d&#39;intérêt (pleine longueur ou le domaine d&#39;) avec F-actine, étape d&#39;ultracentrifugation à granulés de F-actine et l&#39;analyse de la protéine co-sédimente avec F-actine. L&#39;actine co-sédimentation dosages peuvent être conçus en conséquence de mesurer les affinités de liaison et des dosages d&#39;actine concurrence.

Les protéines se lient à l&#39;actine filamenteuse (F-actine) grâce à des modules distincts actine contraignant. Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure de co-sédimentation actine, qui est un test in vitro couramment utilisées pour analyser les protéines ou des domaines spécifiques qui se lient F-actine.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

Le cytosquelette d'actine au sein de la cellule est un réseau de filaments d'actine qui permet le mouvement des cellules et les processus cellulaires, et qui génère ...

Dans la cellule. Le cytosquelette d'actine est une structure dynamique, et son remaniement joue un rôle important dans divers processus tels que la division cellulaire, la migration cellulaire et le transport physique. Un grand nombre de protéines peuvent se lier au cytosquelette d'actine grâce à des modules spécifiques de liaison à l'actine.Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure de co-sédimentation à l’actine, un test in vitro couramment utilisé pour analyser les protéines ou des domaines spécifiques de protéines capables de se lier à l’actine filamenteuse. Bonjour, je suis Jody Var du laboratoire de la Dre Diane Barber, du Département de biologie cellulaire et tissulaire de l’UCSF. Dans cette vidéo, je vais vous montrer comment réaliser un test de co-sédimentation à l’actine.Cette procédure constitue une méthode pour analyser les protéines qui se lient spécifiquement à l'actine filamenteuse et peut être utilisée pour mesurer les affinités de liaison. Cette procédure comprend les étapes suivantes : la formation de filaments d'actine et la préparation de la protéine à tester, l'incubation de la protéine d'intérêt avec l'actine filamenteuse (ou actine F pour faire court), la sédimentation de l'actine F par ultracentrifugation à cent mille ×g, puis une électrophorèse SDS-PAGE suivie d'une coloration de Coomassie afin de visualiser les fractions de surnageant et de culot.Et enfin, l'analyse de la protéine co-sédimentant avec l'actine F dans la fraction pellet. Commençons donc. Afin de préparer des filaments d'actine, il est recommandé de s'assurer que l'actine avec laquelle nous travaillons est sous forme monomérique.Une solution mère d’actine à 10 M par ml est prélevée du congélateur à moins 80 et une dilution de travail à 2,4 mg par ml est préparée dans un tampon contenant du tris, du chlorure de calcium, de l’ATP pour la stabilisation du monomère et du DTT. La dilution de travail est placée sur glace pendant une heure après une incubation d’une heure sur glace. La solution d’actine est centrifugée à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés.Le surnageant obtenu correspondra à l'actine monomérique. À présent, à partir de ces monomères d'actine purifiés, on peut générer de l'actine filamenteuse en ajoutant du chlorure de potassium, du chlorure de magnésium et de l'ATP pendant une heure. À température ambiante, l'actine filamenteuse est désormais prête à être incubée avec la protéine ou le domaine protéique d'intérêt, ce que nous vous montrerons à l'étape suivante.Pour procéder au test de co-sédimentation de l'actine, nous devons préparer la protéine à tester. Aujourd'hui, j'utilise le clan, qui a été purifié sous forme de protéine de fusion GSC. La protéine est préalablement débarrassée des agrégats par ultracentrifugation, et le surnageant obtenu est désormais prêt à être utilisé dans le test.Afin de tester la liaison de la protéine à l’actine, l’actine doit être en excès. Dans ce cas précis, 10 microgrammes d’actine sont incubés avec cinq microgrammes de protéine dans un tampon contenant du Tris, de l’ATP, du BT, du captoéthanol, de l’EDTA et du chlorure de calcium, afin d’obtenir un volume total de 150 microlitres pour l’incubation protéine-actine. Les incubations sont réalisées directement dans des tubes d’ultracentrifugation pendant une heure à température ambiante. Les tubes un et deux représentent les témoins. Le tube un contient uniquement de l’actine dans le tampon.Deux contient uniquement la protéine dans le tube tampon. Trois contient à la fois l’actine et la CNU de la queue de tailn dans le tampon deux. Quatre est un témoin supplémentaire pour la liaison non spécifique, contenant uniquement l’actine et la protéine GST. Après une heure d’incubation, nos échantillons sont soigneusement placés dans le rotor Beckman.Nous avons ensuite réglé l'ultracentrifugeuse à cent mille G et fait tourner les échantillons pendant 20 minutes à 22 degrés C. Après cette centrifugation, nous avons pu préparer nos échantillons pour une électrophorèse sur gel SDS-PAGE. À l'issue des 20 minutes de centrifugation, les échantillons sont soigneusement retirés du rotor afin de ne pas perturber le culot. Une marque est faite sur le côté du tube à l'endroit où se trouve le culot.Il faut faire attention lors du transfert du surnageant dans des tubes Eppendorf auxquels est ajouté un tampon d'échantillonnage XSCS 5X. Un tampon d'échantillonnage 1X XSCS est ajouté au culot restant dans les tubes d'ultracentrifugation. Après avoir pipeté plusieurs fois vers le haut et vers le bas, le culot en suspension est transféré dans un nouveau tube Eppendorf. Les échantillons sont ensuite portés à ébullition dans un bloc chauffant pendant un maximum de 10 minutes. Après ébullition, les échantillons sont chargés sur un gel SDS-PAGE. Ici, j'utilise un gel préparé à 10 %.Les échantillons sont soigneusement chargés dans les puits selon l'ordre correct. Le gel est ensuite électrophoréssé à volts constants pendant environ une heure à température ambiante. Une fois l'électrophorèse terminée, nous colorons le gel avec du bleu de Kumasi afin de visualiser les protéines.Les solutions bleues Kumasi doivent recouvrir complètement le gel. Le gel est laissé sur un agitateur pendant au moins 20 minutes. Ensuite, la solution bleue ESI est éliminée et le gel est plongé dans la solution de révélation.Le gel est laissé à l'obscurité pendant environ une heure sur un agitateur jusqu'à l'apparition de bandes dans le gel. Après la coloration au kumasi, le gel peut être analysé pour déterminer la quantité relative de protéines dans les fractions surnageante par rapport aux fractions de culot. En examinant le gel qui apparaît dans les bandes une et deux, nous pouvons observer les fractions surnageante et pelliculaire d'acton seul.Dans les bandes trois et quatre, nous avions les fractions de surnageant et de culot du C teer tailn seul. Dans les bandes cinq et six, nous avions les fractions de surnageant et de culot de l'acton et du C de tail après incubation. Dans les bandes sept et huit, nous avions les fractions de surnageant et de culot de l'incubation de l'actine et de la protéine GST.Comme vous pouvez le constater, le CT de la queue n'est visible que dans la fraction du palais à la voie six. Les résultats de ce gel indiquent une liaison spécifique du bout C, la queue, à l'actine. Dans cette vidéo, vous avez pu observer comment réaliser un test de cosédimentation avec l'actine.Les dosages de sédimentation de l'actine sont une méthode in vitro permettant d'analyser les protéines liant l'actine. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit les points suivants : pré-éliminer votre protéine d'intérêt et inclure un contrôle négatif composé uniquement de la protéine pour chaque incubation protéine-actine.Ce témoin permettra de vérifier si l'une des protéines pré-clarifiées se sédimente seule, car la liaison à l'actine peut être sensible au pH, à la température ou à la concentration en sel dans le tampon. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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